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Tetronate類抗生素是一類以乙酰乙酸內酯基團為特征且數量持續增長的天然產物，因其多樣的生物活性和特征結構而備受關注。值得注意的是，由環己烯和tetronate片段以螺環方式相連形成的大環化spirotetronate產物，如chlorothricin、kijanimicin和lobophorin A等，是tetronate家族中最具代表性和數量最龐大的成員。其經典的核心結構已被證明遵循統一的生物合成邏輯：在形成成熟的tetronate線性聚酮后，由兩步酶促分子內Diels-Alder（IMDA）級聯反應完成骨架組裝（圖1A）。然而，在線性聚醚tetronate類天然產物（如tetronasin和tetronomycin）的生物合成中，催化上述級聯D-A反應的兩類同源蛋白發揮了不同的功能，依次催化了一步雜D-A反應和一步周環重排（圖1B）。這些研究體現了同源生物合成酶在進化過程中的功能創新，從而驅動天然產物的化學多樣性。

本課題組聚焦非經典tetronate天然產物lucensimycin A，開展生物合成研究，通過體內基因敲除、體外酶學表征、化學衍生化策略和結構生物學手段，完整解析了其生物合成途徑，并揭示通過酶促立體選擇性親核取代反應構建非典型螺環骨架的全新機制（圖1C），相關成果發表于Journal of the American Chemical Society。

圖1

Lucensimycin A（1）的核心結構為罕見的由多氫菲和tetronate以螺環方式相連（spiro[tetronate-hydrophenanthrene]）的四環骨架，并且該螺環中心的立體構型長期未被解析。與常規的含有spiro[tetronate-hexene]的spirotetronate類大環化合物的五環結構相比，1的剛性四環結構中含有一個類似的萘環片段，而tetronate基團的環外雙鍵卻依舊保留，暗示了其螺環的形成與經典的依賴IMDA反應的螺環形成存在差異，可能涉及獨特的環化策略。 

圖2

通過基因簇比對發現：lucensimycin A的基因簇（luc）與經典spirotetronate基因簇（chl）高度同源，包含保守的聚酮合酶（PKS）、tetronate形成模塊（LucL1-L5）及兩類D-A同源酶（LucM/LucK）（圖2B）。在對lucL1-L5進行敲除和表達的過程中，研究人員依次鑒定了tetronate成熟過程中關鍵的羥基（3）、乙?；?/span>4）和脫水中間體（5），證實其tetronate基團的生物合成遵循保守途徑，與abyssomicin、agglomerin等tetronate聚酮的合成策略一致。

LucM與LucK分別和pyrroindolmycin生物合成中的D-A酶PyrE3 (39%/100%)和PyrI4 (22%/62%)同源。lucM的敲除結果表明，LucM作用于tetronate形成模塊的下游；結合體外酶反應，進一步證實LucM能夠通過endo選擇性的IMDA反應，催化線性前體高效構建十氫萘環核心骨架（6）。這一催化過程與PyrE3在pyrroindolmycin生物合成途徑中所發揮的功能高度相似。 

圖3

ΔlucK敲除株積累了三個代謝產物7（6的2-羥基乙?；苌铮?、8和8'。基于NOE分析、DFT 計算和SNAC衍生化，8和8'被證實具有相同的四環平面結構，其差異僅在螺環中心C-12的立體構型（8: 12R；8': 12S）。研究人員發現，7在酸性條件下會迅速自發轉化為8和8'，轉化比例為3:1；而在中性條件下，LucK可高效催化7向8的轉化（90% de）。投喂實驗顯示，僅8能特異性恢復終產物1的產生，證實其為真正的生物合成中間體，并確立1螺環中心的立體構型與8一致。上述實驗結果表明，D-A酶同源蛋白LucK在lucensimycin A生物合成過程中，并未識別底物中潛在的D-A反應活性基團，而是罕見地催化了一步分子內親核取代反應，立體選擇性地形成非典型的螺環中心。此外，體內結果表明，LucM與LucK并非連續作用，而是由酰基轉移酶LucN對LucM的催化產物乙?；揎椇?，再進行環化。

在完成spiro[tetronate-hydrophenanthrene]四環骨架的構建后，化合物8的四烯鏈末端仍需經歷氧化裂解過程，才能形成終產物1。進一步的敲除實驗和體外酶反應證實，LucO3作為首個在非類胡蘿卜素天然產物生物合成途徑中被表征的類胡蘿卜素裂解雙加氧酶（CCD），可特異性催化化合物8末端烯烴的氧化斷裂，生成醛基中間體；LucI繼而催化該醛基氧化為羧酸，最終完成lucensimycin A的生物合成（圖2C）。 

圖4

最后，鑒于LucK相較于其同源蛋白在tetronate類天然產物生物合成途徑中的特殊催化功能，本研究解析了LucK 1.9 ?的晶體結構，其三維結構呈現保守的β-桶狀折疊，通過分子對接和點突變實驗，證實其依賴Glu16/Glu85驅動親核環化反應的酸堿催化機制（圖4）。

本研究完整解析了非典型tetronate類天然產物lucensimycin A的生物合成過程。其中，關鍵的環化酶LucK立體選擇性地催化了一步親核環化反應，從而形成罕見的spiro[tetronate-hydrophenanthrene]四環骨架。針對LucK的結構解析，初步揭示β桶狀蛋白通過廣義酸堿催化機制介導的全新反應類型，為tetronate類化合物的化學多樣性與生物合成之間的關系提供了新見解，同時也暗示了在天然產物生物合成途徑中，大量由已充分表征的酶催化劑所介導的非經典酶促轉化仍有待進一步發掘。

南京大學化學化工學院博士生奚萌宇為文章第一作者，戈惠明教授和張博副教授為通訊作者。該研究得到了國家自然科學基金委及科技部項目經費的資助。

文獻詳情：

Enzymatic Stereoselective Nucleophilic Cyclization Governs AtypicalSpirotetronate Assembly in Lucensimycin A Biosynthesis 

Meng Yu Xi，Bo Zhang*，Ting Peng，Xiu Xiu Ma，Ao Zhu，Zi Jie Wang，Yucheng Gu，Ren Xiang Tan，Hui Ming Ge*

J. Am. Chem. Soc. 2025

https://doi.org/10.1021/jacs.5c07754

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