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針對上述挑戰，近日，湖南大學何清課題組基于超蕃功能分子體系發展了一類人工單分子類酶催化劑（簡稱單分子酶，Singzyme），實現了多功能酶模擬。在這項工作中，作者設計并合成了光敏超蕃1—一種獨特的共價有機籠，其特征在于六個橋接單元連接兩個平行苯環形成的籠狀結構（圖1d）。這種由六個光敏吩噻嗪單元構成的超蕃單分子酶，與吩噻嗪基的對照化合物（籠2、大環3和單體4）相比，表現出顯著增強的光吸收能力、優異的光生電子分離能力和轉移效率，并顯著降低了光生載流子的復合（圖2a）。作者將這種特殊的光敏性歸因于“超籠效應”或“超蕃效應”，這是一種與已建立的聚合物和大環效應互補的增強機制。功能化后的吩噻嗪單元密集的排列形成了超蕃1的3D納米級空腔，賦予其類酶行為，使其能夠高效且有選擇性地光催化氧化有機底物。在間歇性光照下，超蕃1模擬了NADH氧化酶(NOX)和谷胱甘肽氧化酶(GSHox)活性。這種雙重類酶活性促進了NADH（一種關鍵的代謝輔助因子）和谷胱甘肽（癌細胞中的過表達物質）的靶向氧化，從而產生活性氧（ROS）并誘導氧化應激。上述類酶活性通過協同凋亡和鐵死亡的途徑導致癌細胞死亡，使超蕃1成為具有重要潛力的多功能分子平臺，在光催化治療和基于氧化還原的抗癌策略中具有重要意義。

圖1：通過將活性位點整合到（a）聚合物;（b）MOFs;（c）COFs中來獲得類酶性質的典型策略。（d）基于超蕃的單分子酶的示意圖（在本研究中報道）和球形硫加氧酶還原酶的俯視圖。

自然界中，許多酶通過蛋白質單體或亞基協同組裝形成的準封閉或全封閉空腔結構，實現精確的分子構型與催化功能。受這類結構的啟發，作者通過將功能化的吩噻嗪單元引入超分子框架中來精確設計納米級單分子類酶結構，并命名為“Singzyme”。 超蕃1中每個橋都使用功能化后的吩噻嗪，并添加C8碳鏈以增強化合物溶解度（圖2a）。為了進行比較，作者合成了一系列對照化合物：含有三個吩噻嗪單元的籠2，含有兩個吩噻嗪單元的大環3，和含有單個吩噻嗪單元的單體4。此外，X射線單晶衍射表明超蕃1呈燈籠狀結構，兩個苯環由六個含吩噻嗪的橋連接（圖2c）。值得注意的是，該結構類似于球形酶，其核心尺寸高約2.0 nm，直徑約1.6 nm。

圖2：（a）超蕃1和對照化合物籠2、大環3、單體4的結構；（b）超蕃1、籠2和大環3的合成路線；（c）超蕃1的單晶結構。

考慮到光敏吩噻嗪單元在超蕃1的腔周圍密集排列，作者接下來研究了其光化學和電化學性質。如圖3a所示，超蕃1的UV-Vis漫反射光譜顯示出300 - 500 nm之間的吸收帶。隨著吩噻嗪單元的數目減少，吸收邊帶的逐漸藍移。這種趨勢表明超蕃1具有最高的光捕獲能力。此外，固態顏色從超蕃1中的棕黃色轉變為單體4中的淺黃色。

超蕃1的光學帶隙（Eg）約為2.45 eV，顯著窄于其他三種對照化合物（圖3b），表明其具有增強的電子離域性。光致發光光譜（圖3c）顯示，隨著吩噻嗪單體的增加，熒光強度下降，PL發射從480 nm逐漸紅移到515 nm，同時譜帶變寬。超蕃1的顯著紅移和增寬可能是由于共軛程度增加和電子相互作用增強。上述結果表明超蕃1可通過系間交叉（ISC）進行光誘導電子轉移，這一過程有利于生成生物應用所需的活性氧物種。采用電化學阻抗譜（EIS）和光電流響應測試對超蕃1的電化學性能進行了研究。如圖3d，e所示，EIS譜表明，與對照化合物相比，超蕃1最低的電阻值和最高的光電流響應表明其在電荷轉移過程中具有最高效的載流子分離和遷移能力。同時超蕃1在六個照射周期內保持穩定的光電流響應，表明其在光照下能連續且穩定的電子-空穴產生。

通過Mott-Schottky曲線分析確定四種化合物均為n-型半導體（圖3f）。這些化合物的導帶電位與它們的平帶電位非常接近。經標準氫電極校準后，超蕃1的導帶電位為-0.47 V，籠2為-0.52 V，大環3為-0.53 V，單體4為-0.55 V。計算超蕃1的價帶電位約為1.98 V，籠2為2.06 V，大環3為2.09 V，單體4為2.14 V。結果表明，這四種化合物都能夠還原O₂形成超氧自由基（O₂^??）。為了進一步評估這些光敏劑的ROS生成能力，作者使用DMPO和TEMP分別作為O₂^??和¹O₂的捕獲劑進行ESR測試（圖3g，h）。激光照射含有同樣吩噻嗪當量的四種化合物的溶液時，由于“超籠效應”，超蕃1表現出最高的O₂^??和¹O₂產生速率。接著，作者采用循環伏安法，研究了這4種光敏劑的氧化還原性能。如圖3i所示，每種光敏劑顯示相似的可逆氧化峰，起始氧化電位從單體4到超蕃1逐漸降低，這表明超蕃1的氧化變得更加容易。

圖3：超蕃1、籠2、大環3和單體4的光學和電化學性質。（a）UV-Vis漫反射光譜；（b）用于光學帶隙估計的Tauc圖；（c）光致發光光譜（E_x: 380 nm，狹縫寬度：5 nm/5 nm）；（d）電化學阻抗譜（EIS）Nyquist圖；（e）在可見光照射下的光電流測量;（f）經NHE校準后四種化合物的價帶導帶位置和光學帶隙；（g）以DMPO作為捕獲劑的ESR譜；（h）以TEMP作為捕獲劑的ESR譜；（i）循環伏安圖。

基于上述光化學性質，作者接下來探索了超蕃1在可見光驅動的氧化中的催化效率，即芐胺氧化偶聯和硫醚氧化（圖4a，b）。為了系統地評價“超籠效應”在催化效率中的作用，作者使用芐胺作為模型底物，對四種化合物進行了比較研究。在室溫下照射12小時后，只有超蕃1表現出>99%的芐胺轉化率（圖4c）。超蕃1的周轉數（TON）顯著提高，分別是籠2、大環3和單體4的3.57倍、10.52倍和33.33倍，表明“超籠效應”在優化光催化效率方面的顯著影響。為了闡明這種增強的催化作用的機理，作者使用各種清除劑和犧牲劑進行了一系列抑制實驗。結果表明，O₂^??為驅動反應的主要ROS，而¹O₂起次要作用。這些結果進一步證實了光催化劑，光源和氧是不可缺少的組成部分。此外，作者還拓展了在優化條件下超蕃1對于氧化偶聯的底物范圍（圖4a）。有機硫化物的光氧化是評估O₂活化和¹O₂生成效率的典型模型反應。如圖4b所示，在1 atm O₂氣氛下，用450 nm LED光源照射3 h，超蕃1有效地催化了硫醚氧化為亞砜，證明了其對污染物降解的潛力。相比之下，三種對照化合物的催化效率與芐胺氧化偶聯中觀察到的趨勢一致，催化效率均顯著低于超蕃1（圖4c）。

圖4：四種化合物催化有機氧化反應的性能。（a）超蕃1對芐胺的光催化氧化偶聯反應；（b）超蕃1對硫醚的光催化選擇性氧化;（c）四種化合物在芐胺氧化偶聯和硫醚氧化有機催化反應中的性能比較。

基于超蕃1在450 nm照射下產生O₂^??和¹O₂的卓越能力，并形成強氧化性自由基物質（superphane*），作者探索了其超越傳統催化劑的更廣泛的催化潛力。細胞內關鍵輔酶NADH和其氧化產物NAD⁺的平衡具有重要意義。作者探究了超蕃1作為模擬NADH氧化酶（NOX）活性的潛力。結果表明，超蕃1的¹O₂的產率達到70%，對NADH的氧化能力均顯著超越籠2、大環3和單體4，具有優異的NOX活性。

在類NOX研究過程中，作者觀察到NADH氧化僅在光照下進行，而在沒有光照的情況下幾乎無活性（圖5a）。因此，作者分析了天然NOX氧化NADH的常見產物，如H₂O₂和NAD⁺。在氧化體系中加入乙醇脫氫酶和乙醇后，在340 nm處的紫外吸收在10 min內恢復到90%，證實了反應的主要產物是NAD⁺而非（NAD）₂（圖5b）。動力學實驗證實了超蕃1顯著氧化特性，其中Michaelis?Menten曲線顯示K_m為70.5 μM，表明與天然NOX（192.9 μM）相比，其對NADH的親和力較強，V_max為17.1 μM min^?1（圖5c、d）。超蕃1和天然NOX的催化常數（K_cat）分別為1.71 min^?1和221.4 min^?1。催化效率（K_cat/K_m）分別為2.43 × 10⁴和114.77 × 10⁴ L mol^?1 min^?1。這些結果表明，超蕃1有可能取代天然酶，實現高效的酶催化反應。

在線粒體呼吸鏈中，NOX不僅將電子從NADH轉移到O₂，還將電子轉移到Cyt c，表現出類Cyt-c還原酶的活性。如圖5e所示，當照射NADH和超蕃1體系時，隨著NADH氧化，Cyt-c被還原，在550 nm處Cyt - c吸收峰增加，并且從409 nm紅移到412 nm，表明Cyt - c中的鐵轉化為亞鐵形式。相比之下，超蕃1僅引起輕微的光譜變化，而單獨的NADH不誘導任何光譜變化，證實了超蕃1介導從NADH到Cyt-c的電子轉移（圖5 f）。根據酶動力學，從Michaelis?Menten曲線（圖5g，h）推導出K_m為40.1 μM，V_max為3.5 μM min^?1。

GSH在調節細胞氧化應激中是必不可少的。作者評估了超蕃1的類GSH氧化酶活性。使用DTNB作為顯色劑，在照射30分鐘內，觀察到超蕃1和GSH溶液的顏色發生了顯著的變化，從亮黃色變為無色（圖5i）。通過Michaelis?Menten曲線，測定其類GSH氧化酶的K_m和V_max值分別為15.6 μM和4.3 μM min^?1，表明其具有較強的類GSH_OX活性（圖5 j）。

在廣泛的TMB/TMBox反應模型研究中，作者觀察到652 nm處的吸收強度隨著TMB濃度的升高而增加（圖5 k）。酶動力學實驗得出K_m和V_max值分別為452.4 μM和16 μM min^-1（圖5l）。考慮到腫瘤微環境的微酸性，作者進一步研究了pH值對超蕃1類酶活性的影響。結果顯示，其類酶功能，特別是NADH氧化類酶、GSH氧化類酶和氧化活性，在酸性條件下增強。

圖5：超蕃1的體外類酶活性。（a）超蕃1的光可控NADH氧化活性；（b）分別由超蕃1和ADH催化的NADH消耗和回收；超蕃1的NADH氧化類酶活性的（c）穩態動力學分析和（d）Lineweaver?Burk圖；（e）超蕃1的Cyt-c還原類酶活性；（f）反應30分鐘后不同溶液的UV?Vis吸收光譜；超蕃1的Cyt-c還原類酶活性的（g）穩態動力學分析和（h）Lineweaver-Burk；（i）超蕃1對GSH的氧化活性；（j）超蕃1的GSH氧化類酶活性的穩態動力學分析；（k）超蕃1的氧化類酶活性；（l）超蕃1的氧化類酶活性的穩態動力學分析。

基于超蕃1的類酶活性，作者進一步研究了其體外催化潛力，重點是其在調節細胞氧化應激中的作用。為了評估生物相容性，作者測試了這四種基于吩噻嗪的光敏劑在四種細胞系（即Hela細胞、MCF?7細胞、Hepa 1?6細胞和3T3細胞）中的細胞毒性。在0-64 μg/ mL濃度范圍內孵育12 h后，細胞存活率保持在90%以上，證實了這些光敏劑具有良好生物相容性。

接下來，作者專注于Hepa 1?6細胞系，以評估超蕃1誘導細胞凋亡的潛力。用不同濃度的超蕃1處理Hepa 1?6細胞。與未輻照組相比，輻照組中細胞發生顯著誘導凋亡。超蕃1的IC₅₀值4.49 ± 0.53 μg/mL，顯著低于其他對照組，突出了其PDT功效。如圖6b所示，與超蕃1共孵育后，Hepa 1?6細胞內的NADH水平降低了66%。NADH的降低抑制了細胞的氧化磷酸化（OXPHOS），導致線粒體膜電位活性降低，ATP水平下降50%。此外，超蕃1產生的ROS結合NADH氧化過程中產生的H₂O₂，促進過表達的GSH氧化為GSSG，使GSH水平降低77%。作為對照組，作者測量了3T3細胞中三種指示劑水平的變化。經NADH水平降低和激光照射后，三種指示劑的水平均略有下降，證實了NADH水平降低有效地破壞了癌細胞的氧化還原穩態，最終誘導細胞凋亡和鐵凋亡，同時對正常細胞表現出可忽略的副作用。

接著，作者進一步研究了超蕃1對氧化應激途徑的影響。光譜分析證實，超蕃1通過NADH氧化產生大量的ROS（¹O₂，O₂^??），包括H₂O₂。這種ROS激增破壞了細胞的氧化還原穩態，引發了“氧爆發”，推動細胞凋亡。使用DCFH-DA（和DHE）染色，作者檢測到在450 nm照射下用超蕃1處理的細胞中顯著升高的細胞內ROS（圖6c）。

此外，超蕃1表現出類似于NADH氧化酶（NOX）的活性，氧化NADH，從而破壞線粒體呼吸鏈內的電子傳遞。這降低了線粒體的OXPHOS并減少ATP產生，導致線粒體功能障礙并促進細胞凋亡。為了評估線粒體膜電位（ΔΨ_m），作者使用JC-1作為熒光探針。如圖6d所示，對照細胞顯示紅色熒光，表明線粒體膜電位完好，而超蕃1處理過的細胞，出現了強烈的綠色熒光，表明ΔΨ_m減少。隨著超蕃1濃度的增加，綠色與紅色熒光比率進一步增加，表明線粒體去極化的濃度依賴性。這些發現表明，超蕃1介導的NADH消耗誘導了“多米諾效應”，導致線粒體損傷和細胞凋亡。最后，作者使用AM/PI染色評估了超蕃1的體外光動力治療效果（圖6 e）。對照組幾乎所有區域都顯示出綠色熒光，表明細胞保持存活。然而在激光照射下，隨著超蕃1濃度增加，紅色熒光區域及空白區域逐漸擴大，標志著細胞死亡率上升。值得注意的是，當超蕃1濃度達到15μg/mL時，幾乎所有細胞均失去活性，這證實了該化合物在光照條件下具有顯著的光動力治療效力。

鑒于光動力療法展現的良好療效，作者引入超蕃1作為NADH氧化酶（NOX）模擬物，其設計初衷是與內源性NOX酶競爭NADH氧化過程。這種競爭引發了一系列氧化還原失衡效應：有效降低細胞內NADH水平，損害電子傳遞鏈功能，從而抑制ATP合成與線粒體呼吸作用。由此導致的線粒體功能障礙進一步抑制了OXPHOS，最終誘發腫瘤細胞的能量耗竭。除NOX模擬活性外，超蕃1還展現出類GSH氧化酶活性，能加速細胞內GSH的氧化過程，進一步加劇氧化應激反應。作為關鍵細胞抗氧化劑之一的GSH被耗竭后，細胞中和活性氧ROS的能力顯著削弱，導致細胞內爆發性氧化應激。急劇升高的ROS水平不僅引發標志鐵死亡的廣泛脂質過氧化反應，同時激活了半胱天冬酶介導的凋亡通路。鐵死亡與凋亡這兩種截然不同的細胞死亡機制協同作用，顯著增強了超蕃1在腫瘤微環境中的細胞毒性效應。

這些結果證實超蕃1是一種能精確調控氧化還原穩態、破壞代謝通路的多酶模擬物。通過發揮其作為類NOX和類GSH氧化酶模擬物的雙重功能，該化合物形成了一種協同治療策略——通過放大氧化應激、耗竭ATP及激活程序性細胞死亡等機制選擇性靶向腫瘤細胞。這種機制上的多功能性，彰顯了其作為新一代超分子抗癌治療劑的巨大潛力。

圖6：超蕃1的體外治療作用。（a）超蕃1處理后，有和無激光照射的Hepa 1?6細胞的細胞活力；（b）用15 μg mL^?1的超蕃1處理的Hepa 1?6細胞中NADH、ATP和GSH的細胞內水平；（c）超蕃1處理后Hepa 1?6細胞內ROS的熒光圖像（15 μg/mL）；（d）超蕃1處理后Hepa 1?6細胞線粒體膜電位（Ψ_m）的變化；（e）不同處理條件下AM/PI染色的Hepa 1?6細胞的CLSM；（f）超蕃1誘導的細胞死亡機制示意圖和超蕃1催化的NADH消耗所觸發的“多米諾效應”的示意圖。

總之，本研究基于“超籠效應”策略設計了超蕃1光敏劑，增強了其光敏性、光催化氧化并賦予癌癥治療等多方面的酶模擬特性。在分子水平優化后，超蕃1表現出顯著改善的光吸收、優異的光生電子分離和轉移以及在低能光下減少的載流子復合，產生了高ROS產率和光催化氧化。其獨特的單分子結構作為單分子酶，展現出類似NADH氧化酶和GSH氧化酶的活性。這使得NADH和GSH能夠被選擇性地耗盡，破壞細胞的氧化還原平衡，引發線粒體功能障礙。這種“多米諾效應”不僅啟動了細胞凋亡和鐵死亡途徑，還伴隨著活性氧積累、氧爆發和GSH耗竭，進一步下調GPX4的表達，加速腫瘤細胞的死亡。值得注意的是，單分子酶1在酸性和中性環境中展現出pH?依賴性的穩定催化活性，這正是腫瘤微環境的特征，突顯了其在對健康細胞影響最小的情況下，實現精準且高效抗癌治療的潛力。這些發現標志著超分子光動力療法和酶?模擬催化領域的重大突破，確立了超蕃作為多功能“單分子酶”的地位。這些“單分子酶”在生物啟發的催化、癌癥治療等方面展現出卓越的能力。此外，單分子酶在氧化還原調節和生化研究中展現出廣泛的應用潛力，突顯了它們對推動基礎科學進步和促進治療創新的變革性影響。

何清，湖南大學教授、博士生導師、國家海外高層次青年人才。2010年7月于湖南師范大學制藥工程系獲學士學位；2015年7月于中國科學院化學研究所獲得理學博士學位；2015年7月–2019年3月在（美國）德克薩斯大學奧斯汀分?；瘜W系從事博士后研究（合作導師為Jonathan L. Sessler教授）；2019年入選國家海外高層次人才青年項目回國工作，任湖南大學化學系教授。主持/承擔國家自然科學基金面上項目、青年項目及國家重點研發計劃子課題等多項課題。主要研究方向為超分子化學和新型功能材料，包括分子籠化學（超蕃化學與塔籠化學）、新型非共價相互作用力、先進超分子材料（非多孔非晶態超吸附材料、超分子離子傳導膜）和超分子分離技術。在Sci. Adv.、Nat. Commun.、Chem.、J. Am. Chem. Soc.、Angew. Chem. Int. Ed.、Adv. Sci.、Adv. Energy Mater.、Chem. Rev.、Chem. Soc.Rev.、Acc. Chem. Res.、Coordin. Chem. Rev.、CCS Chem.等國際著名期刊上發表學術論文60余篇，申請/授權專利8項。榮獲2025年度“Thieme Chemistry Journals Award”學術獎。目前擔任《四面體》（Tetrahedron）和《四面體快報》（Tetrahedron Letters）青年編委、《Tetrahedron Chem》客座編輯。