內(nèi)容
生物催化與化學催化結(jié)合對可持續(xù)合成重要構(gòu)建塊具有巨大潛力,但酶對水性環(huán)境的嚴格要求及在苛刻條件下的穩(wěn)定性不足,限制了高效級聯(lián)反應(yīng)的開發(fā)。傳統(tǒng)金屬催化常需有毒溶劑和苛刻條件,會導致酶在有機溶劑中溶解度和活性降低。利用膠束制作的PCRM (Prefabricated Catalyst-Reactant Mixtures) 是一種用于整合酶促鹵化與金屬催化偶聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵策略, 可在水中實現(xiàn)有機與酶促反應(yīng)的串聯(lián),隔離酶與化學催化劑,為解決兩者兼容性問題提供可能。基于此,研究團隊開發(fā)H3CP平臺,整合酶促與金屬兩種催化優(yōu)勢,實現(xiàn)區(qū)域選擇性 C-H 官能化。
平臺核心組成:(圖1)
酶促鹵化:利用黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)依賴的鹵化酶(FDHs)和釩依賴的鹵過氧化物酶(VHPOs),對底物進行區(qū)域選擇性鹵化,為后續(xù)交叉偶聯(lián)反應(yīng)引入溴原子。
赫克偶聯(lián):在膠束PCRM于水中形成的原位反應(yīng)容器中,進行水相鈀催化的赫克偶聯(lián)反應(yīng),實現(xiàn)碳-碳鍵的形成。
酶促水解:使用豬肝酯酶(PLE)催化酯的皂化反應(yīng),得到目標丙烯酸產(chǎn)物。
(圖1,來源:Angew. Chem. Int. Ed.)
研究人員首先研究了區(qū)域選擇性酶促鹵化反應(yīng)。他們利用黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)依賴性鹵化酶(FDHs)和釩依賴性鹵過氧化物酶(VHPOs)對多種底物進行選擇性官能化。篩選三種 FDHs(RebH、PrnA 和 PyrH),發(fā)現(xiàn)它們對 23 種不同底物表現(xiàn)出不同偏好。例如,PyrH 在 1a、2a、4a-6a 和 14a 上表現(xiàn)最佳,PrnA 適用于 7a 和 12a,RebH 則在 8a-11a 和 13a 上效果良好。引入 AmVHPO 拓展底物范圍至 15a-23a,實現(xiàn)對茴香醚、取代苯酚、苯胺和雜環(huán)化合物的選擇性鹵化。(圖2)
(圖2,來源:Angew. Chem. Int. Ed.)
隨后,研究者將酶促鹵化與Heck偶聯(lián)直接在同一容器中結(jié)合。其采用的PCRM (Prefabricated Catalyst-Reactant Mixtures) 策略,作為預組裝的反應(yīng)體系,能夠在水性介質(zhì)中形成動態(tài)的疏水反應(yīng)微環(huán)境,將金屬催化的赫克偶聯(lián)反應(yīng)限制在膠束內(nèi)核進行,同時兼容酶促反應(yīng)的水性外環(huán)境,避免酶與化學催化劑的直接接觸和失活,且簡化了反應(yīng)操作。即使存在酶促鹵化步驟的殘留(如緩沖液、輔因子、酶等),反應(yīng)產(chǎn)率也無顯著下降。從而驗證了酶促鹵化和 Heck 偶聯(lián)反應(yīng)可以在同一反應(yīng)體系中直接進行。(圖3&4)
(圖3,來源:Angew. Chem. Int. Ed.)
(圖4,來源:Angew. Chem. Int. Ed.)
作者隨后將鹵化 - Heck偶聯(lián) - 水解三步反應(yīng)整合,對多種底物進行轉(zhuǎn)化。其水解步驟可直接利用前序反應(yīng)液,無需去除 PCRM成分,實驗表明這些成分對水解酶的活性無顯著抑制。(圖5)
(圖5,來源:Angew. Chem. Int. Ed.)
基于此,作者對H3CP進行放大應(yīng)用。初始測試表明,放大反應(yīng)中產(chǎn)率大幅降低是由于,大規(guī)模反應(yīng)中酶易受溫度波動、底物濃度不均等因素影響而導致酶活性下降或酶的穩(wěn)定性不足,從而進一步導致鹵化步驟效率下降。且所用的鹵化酶FDHs和AmVHPO需通過重組E. coli表達并純化,非商業(yè)可得,大規(guī)模反應(yīng)中若直接使用游離酶,會因酶的大量消耗導致成本劇增。
因此,研究者針對兩種不同類型的鹵化酶(FDHs與VHPO),分別采用了交聯(lián)酶聚集體(CLEAs)和分子量截留(MWCO)膜封裝酶兩種策略。
使用CLEAs策略得到的酶催化劑CLEA-FDHs,增強了結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性,重復使用后活性仍超90%。適配的輔因子再生系統(tǒng)有效降低了對NADH的消耗。
MWCO膜封裝酶Encapsulated-AmVHPO,可以允許底物/產(chǎn)物透過膜,有效避免酶與金屬催化劑直接接觸,防止生物催化劑的失活且易于更換。通過緩沖液洗滌再生酶活性,保留100%催化能力。適用于VHPO催化的鹵化反應(yīng)類型。
兩種策略均提升酶穩(wěn)定性與循環(huán)使用能力,突破傳統(tǒng)酶促反應(yīng)放大時因酶易失活導致的產(chǎn)率衰減問題,成功將反應(yīng)放大至1 mmol規(guī)模。(圖6)
(圖6,來源:Angew. Chem. Int. Ed.)
總結(jié)
方法創(chuàng)新:H3CP 平臺有效解決了酶促與化學催化的反應(yīng)不相容性問題,為開發(fā)多功能、可持續(xù)的chemo-enzymatic級聯(lián)反應(yīng)提供了新思路。
綠色合成價值:在溫和水性條件下操作,減少有機溶劑使用,符合綠色化學理念,為復雜分子的經(jīng)濟、環(huán)保合成提供有力工具。
未來應(yīng)用前景:該平臺在藥物合成、農(nóng)用化學品和先進材料制備等領(lǐng)域具有廣闊應(yīng)用潛力,有望推動可持續(xù)生物與化學合成的進一步創(chuàng)新。
作者
慕尼黑工業(yè)大學Ran Zhu為論文的第一作者,亥姆霍茲藥物研究所與德累斯頓工業(yè)大學Tobias Gulder為通訊作者。Tobias A. M. Gulder教授于2014年加入慕尼黑工業(yè)大學并擔任生物系統(tǒng)化學教授(W2),2019年成為德累斯頓工業(yè)大學技術(shù)生物化學主席(W3),并擔任《天然產(chǎn)物報告》(Natural Product Reports)的主編。隨后于2023年擔任亥姆霍茲制藥研究所(HIPS)的部門負責人。Tobias Gulder課題組在HIPS中致力于為有前景的天然產(chǎn)物開發(fā)創(chuàng)新合成策略。
課題組主頁:https://www.helmholtz-hips.de/de/forschung/people/person/prof-dr-tobias-gulder/
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