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Nat. Chem. | 上海交大瞿旭東/趙一雷團隊發現首例雙氧雜Diels-Alder酶

來源:上海交通大學      2025-04-30
導讀:近日,#上海交通大學 生命科學技術學院、張江高等研究院瞿旭東 團隊聯合澳大利亞昆士蘭大學Mehdi Mobli團隊、上海交通大學生命科學技術學院趙一雷團隊及孔旭東團隊,在《Nature Chemistry 》發表題為“An enzymatic dual-oxa Diels-Alder reaction constructs the oxygen-bridged tricyclic acetal unit of (-)-anthrabenzoxocinone”的研究論文,首次揭示了一種新型雙氧雜Diels-Alder (HDA)酶的催化機制,該酶負責II型聚酮天然產物(-)-anthrabenzoxocinone((-)ABX)中手性三環縮酮氧橋結構單元的形成。生命科學技術學院博士后閆曉麗與昆士蘭大學賈新穎博士為論文共同第一作者,瞿旭東教授、Mehdi Mobli教授以及趙一雷教授為論文共同通訊作者;孔旭東長聘教軌副教授,籍順佳和張夢潔等同學為共同作者。本推送將對該研究的計算部分進行詳細解讀。
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研究背景

異雜DielsAlderHDA)反應是一種高效構建六元雜環結構的經典手段,廣泛應用于活性天然產物的合成。盡管HDA反應在化學合成中已有成熟應用,但自然界中僅有少數能夠催化HDA反應的酶,且僅限于單一雜原子的反應體系。

自然界中存在一類具有氧橋三環縮醛結構的天然產物,具有多種生物活性,但其生物合成機制仍不清楚。受到化學合成中以鄰醌亞甲基(o-QM)與羰基發生[4?+?2]環加成生成氧橋三環結構的啟發,研究者推測自然界中可能存在能催化雙氧雜DA反應(dual-oxa DA)的酶。以(?)-ABX為代表的這類化合物,通過化學合成產物為外消旋體且產率不高,探索其天然生物合成機制具有重要意義

研究內容

研究人員此前已確定了(-)-ABX 的芳香骨架 PDA 相關的生物合成基因簇,但其核心結構氧橋三環縮醛的酶促形成機制仍未明確。通過實驗研究人員推測,前體 1 先被 Abx(?)E 立體專一性還原為 (8S)-2,然后通過 Abx(?)F 的催化高效且專一地轉化為 (-)-ABX,若無 Abx(?)F 則會緩慢自發生成 (+)-ABX  (?)-ABX 的混合物。本研究通過實驗和理論計算系統揭示了天然產物 (?)-ABX 中獨特的氧橋三環縮醛結構的形成機制。 

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1--ABX形成氧橋三環縮醛的關鍵步驟。

研究發現,氧橋三環縮醛結構并非通過傳統的脫水環化或SN1SN2機制生成,因為這些路徑無法解釋最終產物的手性構型,也不符合同位素實驗的結果。本研究提出并驗證了一種全新機制:Abx(?)E 催化前體化合物1還原為中間體2;隨后,在 Abx(?)F 的催化下,2脫水生成具有軸手性的 o-QM中間體3,再通過高選擇性的dual-oxa DA反應形成 (?)-ABX 的三環結構。 

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22(?)-ABX的勢能面

為了驗證上述提出的機制,進行了DFT 計算。在非酶環境中,8-OH的消除可以通過鄰位酚(6-OH)基團的質子供給來促進。由于新形成的C7=C8雙鍵會產生軸手性,中間體3可能存在兩種過渡態,TS1DHTS2DH(圖2和圖3a,b)。計算分析表明,脫水反應發生在化學過程的較晚階段,此時6-OH的質子轉移幾乎完成,因此鄰位位置會積累顯著的負電荷。這使得在TS1DH中蒽酰羥基呈反式取向相比于TS2DH中的順式取向更加有利,能量差約為2.5 kcal/mol(圖2和圖3a,b)。這意味著將主要生成(Ra)-3。進一步的8-OH脫水被計算為放能反應,能量釋放為4.4 kcal/mol,這主要歸因于一個分子分解為兩個分子所帶來的熵增益。對于oxa-DA反應,中間體3中的o-QM基團和24位羰基(C24=O)可能有四種合理的取向(圖3c),這取決于C7=C8雙鍵的E/Z構型以及C24取代基的exo/endo取向。然而,由于C9C22之間的芳香鍵連接,實際上只有兩種取向能夠成為可行的過渡態,即TSEDATSZDA(圖3 d, e)。這兩種過渡態分別會生成(R-C8, S-C24)(S-C8, R-C24)(R-C8, R-C24)(S-C8, S-C24)DA加成產物。雖然這兩種過渡態在幾何上均可行,但TSEDA在能量上無法達到,其能量比TSZDA高出38.0 kcal/mol(圖3e)。因此,只有TSZDA的加成產物可以生成,即(?)-ABX (R-C8, R-C24)(+)-ABX (S-C8, S-C24),這一結果與實驗結果一致

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3QM計算支持并解釋了Abx(-)F的立體特異性dual-oxa DA環化反應

隨后,為了理解中間體3Abx(?)F的存在下如何專一性地發生oxa DA反應,我們利用理論酶模型探討了Abx(?)F可能的反應機制。假設酶促脫水與非酶促脫水的內在反應能量相同,根據理論酶模型,形成預反應態PRS)大約需要8.7 kcal/mol的能量(圖3a,b)。結合過渡態TS0DH的能量信息,模型預測酶促反應的整體能壘不會超過16.3 kcal/mol,比非酶促反應低3.2 kcal/mol,這相當于在Abx(?)F存在下反應速率提升了約226.7倍。

為了深入了解Abx(?)F的催化機制,本研究確定了該酶的晶體結構,通過NMR分析確定了Abx(?)F的結合位點。進一步研究表明,(?)-ABX通過π–π堆積作用與Abx(?)F的特定區域結合,關鍵的氨基酸殘基通過穩定底物構象,促進脫水和雙氧-DA反應。此外,芳香環的構象發生重要變化,旋轉約90°,使6-OH基團形成關鍵氫鍵,這一過程通過分子動力學模擬得到驗證。通過突變Abx(?)F的關鍵殘基,確認D17在脫水反應中至關重要,可能作為通用堿促進6-OH去質子化并促進8-OH的離去。W15Y48Y78S60與立體控制相關,因為它們在oxa DA反應中影響(+)-ABX的生成。

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4 ONIOM計算Abx(-)F中的催化機理

為了進一步揭示Abx(-)Foxa DA反應中的作用,使用ONIOM方法模擬了蛋白質中的過渡態TSZDA(圖4)。計算得出Abx(-)F中的反應勢壘為 9.6 kcal mol-1,遠低于水溶液中估計的 17.4 kcal mol-1(圖2),證實了Abx(-)F作為DA酶的作用。D17羧基的羥基通過橋接水分子與C24羧基形成氫鍵,從而降低了親二烯的電荷密度,使DA反應更加有利。W15S60D17形成了一個擴展的氫鍵網絡,從而提高了酶-底物復合物的幾何穩定性。此外,兩個β片上的相鄰殘基(包括 W125I105Y48Y78Q108T131M50L106M111)產生了模板效應,將TSZDA的蒽基基團緊密地固定在DA 反應中。然后,L64-G73環的動態運動為在DA反應中翻轉苯環提供了必要的空間。

通過整合實驗和計算數據,本研究提出了Abx(-)F催化的oxa DA反應的兩步機制。S60側鏈首先與D17形成氫鍵,以增強羧基的堿性,而羧基則作為一般堿基使化合物2的酚基6-OH去質子化。去質子化會引發分子內部的重排,包括新生苯氧基陰離子的電子遷移以及8-OH的質子化和脫水,從而形成能量有利的(ZRa)-3。最后,在Abx(-)F底物結合袋的限制下,(Z, Ra)-3采用一種特定的受限構象(TSZDA),發生oxa DA反應,生成(--ABX


總結

1)實驗首次發現并鑒定了一種可催化雙氧雜狄爾斯–阿爾德(dual-oxa DA)反應的天然酶Abx(?)F,該酶來自一種類鄰位氧螯合(VOC)蛋白家族,具備雙功能催化活性,既能催化底物脫水,又能立體選擇性地促使[4+2]環加成反應,成功構建了(-)-anthrabenzoxocinone(-)-ABX)中的氧橋三環縮醛結構。這是首次報道自然界中存在可催化含兩個氧雜原子的多雜原子DA反應的酶,突破了此前僅能處理單一雜原子DA反應的局限。

2)實驗通過晶體結構解析、核磁共振(NMR)復合物結構分析、同位素標記實驗及密度泛函理論(DFT)計算,深入揭示了Abx(?)F催化反應的分子機制。研究發現,該酶通過Asp17殘基作為一般堿,啟動底物脫水生成o-苯醌甲基(o-QM)中間體,進而誘導雙氧雜DA反應的發生。

3)結構分析明確了酶與底物及產物的結合方式,為其立體選擇性提供了結構基礎。該研究不僅驗證了酶催化復雜多雜原子環加成反應的可行性,也預示了自然界中或許還存在其他類似的多雜原子DA酶,為今后的酶工程和天然產物合成提供了新思路和工具。

文獻詳情:

An enzymatic dual-oxa Diels–Alder reaction constructs the oxygen-bridged tricyclic acetal unit of (–)-anthrabenzoxocinone 
Xiaoli Yan, Xinying Jia, Zhenyao Luo, Shunjia Ji, Meng-Jie Zhang, Hui Zhang, Mingjia Yu, Julien Orts, Kai Jiang, Zhi Lin, Zixin Deng, Xu-Dong Kong, Bostjan Kobe, Yi-Lei Zhao, Mehdi Mobli & Xudong Qu 
Nat. Chem.2025 
https://doi.org/10.1038/s41557-025-01804-0
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