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在生命體系中精準可控地操縱無機物的合成與利用，是中心法則無法實現(xiàn)的。細胞具有精細而復雜的代謝網(wǎng)絡，合理利用這些天然的生化反應，能在活細胞內(nèi)合成無機功能納米晶體并加以利用，例如合成和操縱半導體熒光量子點，尤其是近紅外量子點，將為原位標記精細脆弱的細胞組分奠定基礎，對于高保真地獲取復雜生命過程中的動態(tài)信息具有重大意義。同時，將為利用精巧的亞細胞結構構筑新的非天然功能的分子機器體系開辟新的道路。然而，活細胞合成引入的外源試劑及其誘導細胞產(chǎn)生的物質（如活性氧，ROS）常常會導致細胞損傷，進而降低胞內(nèi)合成效率，極大地阻礙了活細胞精準合成無機物領域的發(fā)展。

自2009年起，龐代文研究團隊一直致力于無機熒光納米晶體的活細胞可控合成（Adv. Funct. Mater. 2009, 19 (15), 2359-2364；ACS Nano 2013, 7 (3), 2240-2248；Nat. Protoc. 2025, DOI: 10.1038/s41596-024-01133-5；ACS Nano2014, 8(5), 5116-5124; Natl. Sci. Rev. 2022, 9 (6), nwab162; Natl. Sci. Rev. 2024, 11 (3), nwae021），開創(chuàng)了量子點活細胞合成方法，即通過巧妙地耦合細胞內(nèi)不可能自然交會的硒代謝途徑及金屬離子解毒途徑，實現(xiàn)了半導體熒光納米晶體的活細胞合成。最近，該團隊以《Making Cells as a "Nirvana Phoenix": Precise Coupling of Precursors Prior to ROS Bursts for Intracellular Synthesis of Quantum Dots》為題在JACS上報道了一種既能合成量子點又可保持細胞活力的調控策略，通過精準耦合低毒性陰陽離子前體，實現(xiàn)了細胞內(nèi)近紅外Ag₂Se量子點的合成，既高效合成量子點，也有效維持了細胞活力。

發(fā)現(xiàn)了細胞適用的硒代胱氨酸((Cys-Se)₂)能被代謝還原為生物相容性的低價態(tài)硒前體硒代半胱氨酸（Se-Cys）且不會誘導胞內(nèi)ROS累積，該活性前體可被及時添加的銀-谷胱甘肽（AgSG）捕獲，并轉化為近紅外Ag₂Se量子點（Scheme 1）。相比于前期使用SeO₃^2?/Ag⁺的合成方法，該生物相容性調控策略避免了細胞毒性HSe^?的生成和ROS的爆發(fā)，使細胞活力從4%提高到80%，同時細胞合成Ag₂Se量子點的熒光增強了8.7倍。這種具有穩(wěn)定的近紅外熒光功能的腫瘤細胞（Ag₂Se@Cells）仍保持其在活體水平上的增殖、成瘤、侵襲和轉移能力，使長期追蹤細胞分裂和疾病的發(fā)生發(fā)展成為可能，也為活細胞原位定點標記及活體組織標記奠定了堅實基礎，具有重要的生物醫(yī)學意義。

Scheme 1. Illustration of Live-Cell Synthesis of NIR Ag₂Se QDs. Reactive Se precursors, such as hydrogen selenide ion (HSe^?) and selenocysteine (Se-Cys), are produced through distinct metabolic reduction pathways of selenocystine ((Cys-Se)₂) and SeO₃^2?. Precise coupling of low-cytotoxic precursors can effectively maintain cell viability and facilitate QD synthesis. Selenodiglutathione (GSSeSG), glutathioselenol (GSSeH), glutathione (GSH), glutathione reductase (GR), elemental selenium (Se(0)), selenocysteinyl glutathione (CSe-SG), Ag-glutathione (AgSG).

Figure 1. Live-cell synthesis of Ag₂Se QDs using (Cys-Se)₂ as a Se source. (a) Fluorescence spectra of intracellular synthesized Ag₂Se QDs, using (Cys-Se)₂, SeMet, SeMC, or SeO₃^2? as Se source, and Ag⁺ as Ag source. (b) Time-dependent cellular uptake of (Cys-Se)₂ and SeO₃^2?. (c) Photograph of cells incubated with (Cys-Se)₂ or SeO₃^2?. (d) High-angle annular dark field scanning transmission electron microscopy (HAADF-STEM) images and energy dispersive X-ray spectroscopy (EDS) mapping of Se nanoparticles in cells incubated with (Cys-Se)₂ (upper) or SeO₃^2? (lower) for 2 h.

本文基于團隊提出的“時-空”耦合策略，在小鼠乳腺癌細胞4T1中實現(xiàn)了Ag₂Se量子點的合成。實驗結果表明，相較于硒代蛋氨酸（SeMet）和硒（甲基）硒代半胱氨酸（SeMC），采用(Cys-Se)₂合成的量子點熒光強度顯著提升。該現(xiàn)象源于(Cys-Se)₂中Se-Se鍵的鍵能（172 kJ/mol）低于SeMet和SeMC中Se-C鍵的鍵能（244 kJ/mol），這種鍵能差異使得(Cys-Se)₂更易被代謝還原為活性硒前體，從而促進胞內(nèi)量子點的合成。此外，與傳統(tǒng)合成體系中的SeO₃^2?相比，(Cys-Se)₂不僅具有更高的細胞攝取效率，還可避免還可避免硒源因過早形成硒納米顆粒而導致的利用率降低，最終使細胞合成量子點的熒光提升2.1倍。

當(Cys-Se)₂與細胞孵育2小時后，胞內(nèi)未檢測到ROS特異性熒光信號。在相同孵育時長條件下，(Cys-Se)₂的細胞毒性顯著低于SeO₃^2?。但值得注意的是，當孵育時間延長至6小時后，(Cys-Se)₂同樣可引發(fā)顯著的細胞毒性并伴隨硒納米顆粒生成。這些結果表明，與SeO?2?類似，(Cys-Se)?也可通過代謝還原生成HSe?等細胞毒性中間體。分析其代謝途徑可知：(Cys-Se)?優(yōu)先被代謝還原為Se-Cys，再轉化為HSe?。這種時序性代謝特征為精準調控胞內(nèi)量子點的合成提供了關鍵窗口期：在(Cys-Se)處理2小時后及時引入銀源AgSG，可有效捕獲Se-Cys合成Ag₂Se量子點，阻斷Se-Cys向HSe?的轉化，進而避免因ROS爆發(fā)導致的氧化損傷。

Figure 3. Effect of (Cys-Se)₂ and SeO₃^2? on cellular protein expression. (a) Hierarchical clustering of 959 differentially expressed proteins. Protein counts, selected pathways and biological processes were annotated in each cluster. (b,c) Volcano plots comparing protein expression levels between (Cys-Se)₂ and control groups (b), and SeO₃^2? and control groups (c). Color-coded dots represent significantly altered proteins (fold change > 2) based on two-sided t-test (adjusted p value < 0.05 by Benjamini-Hochberg method). (d-f) Expression levels of selected proteins associated with oxidation-reduction processes. p values were calculated via Student’s t test: ns (non-significant) = p > 0.05, *p < 0.05, **p < 0.01.

通過蛋白質組學分析了(Cys-Se)?與SeO?2?代謝過程對細胞蛋白質表達譜的影響。層次聚類分析表明：在2小時孵育條件下，(Cys-Se)?處理組的蛋白質表達譜較SeO₃²?處理組更為穩(wěn)定，差異表達蛋白主要富集于與氧化還原調控及能量代謝通路。關鍵抗氧化蛋白表達分析顯示，(Cys-Se)?處理組中PRDX1, PRDX2, GPX1, SOD2, CAT 和 SELF的表達水平均未發(fā)生顯著變化，而SeO₃²?處理組則引發(fā)上述蛋白的顯著上調或下調。值得注意的是，在含Se-Cys活性中心的硒蛋白（TXNRD1、GPX1、SELF）中，僅TXNRD1在(Cys-Se)?處理后呈現(xiàn)顯著上調，而SeO₃²?處理則導致下調。這種差異性表達與細胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)的變化相關：(Cys-Se)?的代謝消耗了細胞內(nèi)GSH，優(yōu)先激活了TXNRD1等抗氧化硒蛋白的表達以重建氧化還原穩(wěn)態(tài)；而SeO₃²?處理導致GSH耗竭與ROS爆發(fā)，盡管已經(jīng)上調了過氧化物還原酶PRDX1/PRDX2以發(fā)揮抗氧化保護作用，但過量ROS仍可誘導蛋白質降解。該調控機制解釋了SeO₃²?處理組中TXNRD1等抗氧化蛋白表達下調的現(xiàn)象。以上實驗結果進一步證實，(Cys-Se)?代謝生成低價態(tài)活性硒前體的過程中，能夠維持細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)，這種穩(wěn)態(tài)的維持將有效促進下一步胞內(nèi)量子點的合成。

Figure 4. Characterization of Ag₂Se@cells and Ag₂Se QDs. (a) Fluorescence images of Calcein-AM- and PI-stained Ag₂Se@cells or PBS-treated control cells. (b) Fluorescence intensity of Ag₂Se@cells. (c) NIR-II fluorescence microscopic imaging of Ag₂Se@cells. (d) In-situ TEM and high-resolution TEM (HRTEM) images of Ag₂Se QDs in cells. (e) Transient PL spectra of Ag₂Se QDs.

游離Ag?易與生物分子發(fā)生非特異性結合或被還原，進而誘導細胞壞死性死亡。為此，本文通過引入GSH與Ag?配位形成AgSG以調控胞內(nèi)Ag?釋放。實驗表明：在等濃度條件下，AgSG的細胞毒性顯著低于游離Ag?。將Ag?替換為AgSG進行Ag?Se量子點活細胞合成時，細胞活力從4%提升至80%。以(Cys-Se)?為硒源，系統(tǒng)優(yōu)化了GSH/Ag?摩爾比發(fā)現(xiàn)：當GSH/Ag?=1時，細胞熒光強度達到峰值，較(Cys-Se)?/Ag?體系增強4.1倍，較傳統(tǒng)SeO?2?/Ag?體系增強8.7倍。當GSH/Ag?＞1時，過量GSH與Ag?的強配位作用導致前體反應活性降低，阻礙胞內(nèi)Ag?Se量子點的合成。

透射電鏡表征顯示，采用AgSG和Ag?合成的量子點均呈單分散球形（平均粒徑2.3 nm），其0.24 nm晶格間距為與β-Ag?Se正交晶系(013)晶面匹配。吸收光譜表明， AgSG組量子點的吸光度值顯著高于Ag?組，表明胞內(nèi)量子點數(shù)目增多。另外，時間分辨光致發(fā)光光譜分析顯示，AgSG組量子點熒光壽命延長且短壽命組分占比降低，推測該現(xiàn)象是由于入胞的GSH作為硫醇配體鈍化量子點表面缺陷態(tài)，有效抑制了非輻射復合過程。綜上，AgSG的引入同步提升了量子點合成效率與發(fā)光性能。

通過構建小鼠乳腺癌活體模型，系統(tǒng)評估了熒光細胞在活體水平的生物學行為。將不同處理的4T1細胞移植于小鼠皮下形成三組實驗模型：1-Ag?Se@cells組（(Cys-Se)?/AgSG體系合成量子點）、2-Ag?Se@cells組（SeO?2?/Ag?體系合成量子點）及PBS處理的對照組。實驗結果顯示，1-Ag₂Se@cells組細胞保持良好的成瘤能力，其腫瘤體積增長速率較對照組略有延遲，而2-Ag₂Se@cells組則完全喪失致瘤性。NIR-II熒光監(jiān)測表明，1-Ag₂Se@cells組總熒光強度顯著高于2-Ag?Se@cells組，且熒光信號在21天觀察期內(nèi)保持相對穩(wěn)定。隨著腫瘤細胞的增殖，量子點分布呈現(xiàn)漸進性擴散特征，單個細胞中量子點的密度降低，熒光區(qū)域逐漸擴大，表明細胞分裂導致量子點代際稀釋。與之形成對比，2-Ag₂Se@cells組熒光區(qū)域逐漸縮小，提示死亡細胞被巨噬細胞等免疫細胞逐步清除。此外，1-Ag₂Se@cells組小鼠肺部可見明顯轉移結節(jié)，而2-Ag₂Se@cells組未觀察到轉移灶。以上結果充分說明，基于(Cys-Se)?/AgSG體系的生物相容性調控策略，在賦予細胞穩(wěn)定NIR-II熒光功能的同時，仍保留了腫瘤細胞的增殖、成瘤、侵襲和轉移等生物學特性。

文獻詳情：

Making Cells as a "Nirvana Phoenix": Precise Coupling of Precursors Prior to ROS Bursts for Intracellular Synthesis of Quantum Dots

Juan Kong，An-An Liu，Xia Xu，Bo Tang，Yan-Yan Chen，Wei Zhao，Jianhong Jia，Ling-Ling Yang，Gongyu Li，Dai-Wen Pang*

J. Am. Chem. Soc. 2025

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.5c02861

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