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雜萜天然產物是一類結構多樣、生物活性廣泛的復雜天然產物，目前已發現超過500個化合物（圖1A）。其中，pyripyropene C對?；o酶A：膽固醇?；D移酶（ACAT）表現出強效的抑制活性（IC₅₀為53 nM），zonarol (1)具有神經保護作用，ent-(+)-chromazonarol (2)是一個針對農作物病原菌的潛在防治藥物，mycoleptodiscin A (3)表現出中等的抗菌活性，而pelorol (4)對真菌表現出優異的抑制活性（EC₅₀為7.7 μM）。這些化合物均以drimane骨架（藍色標注部分）與非萜類部分形成獨特的雜合結構，在藥物開發和農業應用方面展現出良好的開發潛力，然而其高效合成一直是一個重要挑戰。

傳統的雜萜天然產物合成策略主要依賴兩種方法（圖1B）：立體選擇性多環化和手性合成子法。立體選擇性多環化方法往往步驟冗長，且在關鍵的生物模擬環化步驟中立體選擇性難以控制。而手性合成子法雖然立體化學明確，但主要依賴植物來源的香紫蘇內酯或香紫蘇醇作為起始原料，需要3-6步的側鏈降解反應才能獲得目標C₁₅中間體，這不僅降低了原子經濟性，也影響了整體合成效率。

近年來，研究發現drimenol (5)和albicanol (6)這類drimane型化合物可以作為替代性手性砌塊，它們能夠與芳基鹵代物直接偶聯，無需碳鏈降解過程，為雜萜天然產物提供了更為簡潔的合成途徑。然而，這些C₁₅化合物在自然界中含量極其有限，且以往報道的異源生產方法產量普遍較低，例如在煙草葉片中表達PhDS基因獲得的drimenol產量僅為392 μg/g鮮重，而在酵母中生產albicanol需要4L培養基和96小時發酵才能獲得8.3 mg產物。這種低效的生產方式嚴重限制其作為手性砌塊的進一步開發。

面對這一關鍵瓶頸問題，研究團隊開發了綜合的微生物工程策略（圖1C）。該策略首先利用“人工兩步法”PhoN-IPK系統來提供萜類前體，這一系統可以將外源添加的五碳醇DMAA/ISO直接轉化為五碳焦磷酸前體IPP和DMAPP，顯著簡化了傳統MVA或MEP途徑（圖1C）。在此基礎上，團隊通過兩個關鍵策略來提升目標產物的產量：策略1引入生物合成通路中Nudix水解酶從而提高產物滴度；策略2則通過對PhoN-IPK系統中關鍵磷酸化酶PhoN進行理性設計和改造從而提高底物轉化效率。

在初始階段，研究團隊首先對drimenol合酶進行篩選（圖2A）。通過對比SsDMS、ScDMS和CavC三個來源不同的drimenol合酶，發現它們的產量差異并不顯著（13-15 mg/L）。由于II型萜類環化酶產生的中間產物帶有焦磷酸基團，研究人員猜測大腸桿菌內源水解酶的低效率可能是限制產量的關鍵因素。進一步對drimenol生物合成基因簇分析發現，SsDMS上游存在Nudix水解酶（SsNDH）。經實驗證實，引入SsNDH后產量顯著提升至63 mg/L。

為了進一步優化催化效率，團隊設計了不同的酶表達方式（圖2B）?？紤]到空間鄰近性可能有助于底物傳遞，研究人員構建了SsNDH-SsDMS融合蛋白。通過AlphaFold2預測的結構顯示，兩個酶的活性位點可以通過柔性linker連接實現良好的空間布局。在對linker長度進行優化后（圖2C），產量進一步提升至111 mg/L。預測的融合蛋白結構（圖2D）清晰地展示了SsNDH（粉色）和SsDMS（橙色）通過柔性linker（藍色）形成的空間排布。

盡管通過融合蛋白策略顯著提升了產量，但111 mg/L的產量仍難以滿足實際應用需求。團隊注意到在整個反應過程中，PhoN催化的可逆磷酸化和水解反應可能是另一個關鍵的限速步驟。通過結構分析（圖3A）發現，PhoN的活性位點由K133、R140、S166、G167、H168、R201、H207和D211等殘基組成。對這些位點進行丙氨酸掃描發現突變后產物幾乎完全喪失（圖3B），證實了這些位點的重要性。

基于PhoN催化可逆磷酸化反應的特點，研究團隊提出了一個提高催化效率的新思路：通過在活性口袋附近引入正電荷，增強酶與磷酸基團的相互作用。通過對DMAP和PhoN的分子對接實驗，團隊選擇了位于配體4?范圍內的E122、G125、L158和I171進行定點突變。結構預測顯示（圖3C），在不同位點引入精氨酸或賴氨酸會產生不同的效果：E122R/K突變在底物進入的關鍵位置顯著增加了正電荷，而G125R/K突變雖然增加了電荷但可能會阻礙活性口袋，L158和I171作為內部殘基，帶電突變對口袋表面電荷的影響較小。隨后的實驗結果完全符合這一預測：E122R突變使產量提升至178 mg/L（提高1.6倍），而G125R/K變體產量嚴重下降（分別為17和9 mg/L），L158和I171位點的突變也導致產量顯著降低（均低于10 mg/L）。這種將結構預測與實驗驗證相結合的系統方法，清楚地證明了在活性口袋附近戰略性地引入正電荷可以顯著提高磷酸化效率。

為了進一步優化PhoN的催化效率，團隊轉向了共進化分析策略。通過分析500個與PhoN序列相似度超過80%的酸性磷酸酶序列，利用EMBL-MUSCLE進行多序列比對和ConSurf WEB SERVER進行保守性分析，將氨基酸殘基按保守程度分為九個等級（圖3E）。在距離活性口袋12?范圍內，團隊識別出六個非保守殘基：S90、Y135、K153、T157、R160和I222（圖3E-F）。這些殘基在進化過程中表現出較高的可變性，暗示它們可能是潛在的優化靶點。通過將這些非保守殘基替換為更具保守性的氨基酸，團隊設計了十個PhoN變體。發酵實驗顯示，S90G、T157K和R160K突變使drimenol產量較野生型提高了約1.2倍。這一結果表明，在漫長的進化過程中，這個酶家族確實傾向于進化出更穩定和更高效的形式。

更為可喜的是，當將帶電突變（E122R）與進化分析獲得的有益突變（T157K和R160K）組合時，產生了顯著的協同效應。最優的三突變體E122R/T157K/R160K使drimenol產量達到了398 mg/L，較初始產量提升了27倍。為了解釋這種顯著提升的分子機制，團隊成功解析了PhoN^{E122R/T157K/R160K}的晶體結構（PDB: 8YC1，圖4B-C）。與野生型PhoN相比，三突變體的等電點從6.08升至7.72，表明表面正電荷顯著增加。更重要的是，分子動力學模擬（圖4D）揭示突變體能夠與配體維持長達40 ns的穩定相互作用，相比于野生型PhoN穩定作用時間延長了近20 ns，這可能是其催化效率提升的關鍵原因。

在取得drimenol生產的重要突破后，研究團隊開始評估其在合成中的應用。然而，在初步嘗試drimenol碘代物與芳基碘代物的鎳催化還原偶聯反應時，由于β-H消除反應的發生，主要得到二烯產物。這一結果促使團隊轉向探索albicanol，其碘代物在Weix條件下能夠與不同的芳基鹵代物順利發生偶聯?；谶@一設想，研究團隊將優化后的PhoN-IPK系統應用于albicanol的生產。通過將SsDMS替換為來自Antrodia cinnamomea的環化酶AncC，初始產量即達到281 mg/L。

為了進一步提高albicanol的產量，研究團隊對發酵條件進行了系統優化。通過調控IPTG濃度（0.05 mM）、甘油濃度（2%），以及優化ISO的添加策略，在搖瓶水平將albicanol產量提升至1805 mg/L。更為重要的是，在5L發酵罐中采用兩階段補料策略，即在OD₆₀₀達到30時開始補料，當albicanol達到1.6 g/L時追加8 g ISO，最終使產量提升至3.5 g/L（圖4E），創造了微生物發酵生產albicanol的最高水平。

有了充足的drimane手性砌塊供應后，研究團隊開始探索其在雜萜類天然產物合成中的應用。團隊通過鎳催化的還原偶聯反應（圖5A），建立了一系列雜萜類化合物的簡潔合成路線（圖5B）。這包括zonarol (1)的3步合成（總收率66%），ent-(+)-chromazonarol (2)的4步合成（總收率65%），mycoleptodiscin A (3)的6步合成（總收率22%），以及pelorol (4)的6步合成（總收率14%）。

中國藥科大學董廖斌課題組聯合復旦大學李付琸課題組針對雜萜類天然產物簡潔高效合成問題，創新性地將微生物工程與化學合成相結合，建立了一套完整的交叉學科技術體系。研究團隊通過系統的酶工程改造和結構生物學研究，成功突破了手性砌塊規模化制備的瓶頸，并在分子水平闡明了“人工兩步法”體系中酸性磷酸酶的催化機制。這一發現不僅為后續開發更高效的drimane型手性砌塊生物合成體系提供了理論基礎，也為解決其他萜類化合物的生產難題提供了新思路。更重要的是，該研究為天然產物全合成領域提供新穎的研究范式：通過微生物工程獲取關鍵手性砌塊，繼而通過靈活的化學轉化實現目標分子的高效簡潔合成。這種策略避免了傳統全生物合成中需要組裝復雜酶促級聯反應的困難，同時也克服了有機全合成中手性源獲取困難和步驟冗長的問題，將顯著加速雜萜類生物活性分子的發現和藥物開發進程。