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蘭州大學(xué)王東升課題組Anal. Chim. Acta：創(chuàng)新FRET傳感器檢測(cè)A型肉毒毒素

來(lái)源：蘭州大學(xué)      2024-12-30
導(dǎo)讀：A型肉毒毒素（BoNT/A）是目前已知最強(qiáng)效的神經(jīng)毒素，且在醫(yī)藥和醫(yī)美領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，因此研發(fā)BoNT/A的生物活性檢測(cè)方法對(duì)其中毒診斷和生產(chǎn)中的效價(jià)測(cè)定意義重大。然而，傳統(tǒng)檢測(cè)方法，如小鼠生物檢測(cè)法（MBA），雖然被認(rèn)為是“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其周期長(zhǎng)、成本高、操作復(fù)雜且依賴動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，難以滿足現(xiàn)代工業(yè)的快速生產(chǎn)需求。近期，蘭州大學(xué)王東升教授團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（F?rster Resonance Energy Transfer, FRET）的創(chuàng)新性傳感器體系，為BoNT/A的檢測(cè)提供了全新的技術(shù)解決方案。研究團(tuán)隊(duì)優(yōu)化了FRET熒光對(duì)的設(shè)計(jì)，成功克服了傳統(tǒng)體系中光譜重疊、信號(hào)不穩(wěn)定等技術(shù)瓶頸，通過(guò)更優(yōu)的光譜分離和高效能量轉(zhuǎn)移，顯著提升了檢測(cè)性能。為肉毒毒素檢測(cè)提供了靈敏、快速、無(wú)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的替代方案。該工作以“EGFP/RFP-based FRET Sensors for Botulinum Neurotoxin A Biological Activity Detection and Methodological Validation”發(fā)表在國(guó)際分析化學(xué)Top期刊《Analytica Chimica Acta》上。《Analytica Chimica Acta》是以分析化學(xué)綜合研究為特色的國(guó)際頂尖期刊，專注于分析化學(xué)領(lǐng)域的重要課題和前沿進(jìn)展。
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論文通訊單位：蘭州大學(xué)藥學(xué)院、蘭州大學(xué)稀有同位素前沿科學(xué)中心
論文合作單位：國(guó)藥集團(tuán)中國(guó)生物-蘭州生物-蘭州大學(xué)神經(jīng)疾病藥物聯(lián)合創(chuàng)新中心          
https://doi.org/10.1016/j.aca.2024.343546
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圖1 基于FRET的生物傳感器進(jìn)行BoNT/A的活性檢測(cè)。通過(guò)BoNT/A的底物SNAP25將EGFP和RFP連接起來(lái)，在BoNT/A發(fā)揮活性作用時(shí)，F(xiàn)RET現(xiàn)象減弱或消失，以此測(cè)定BoNT/A的活性。
研究團(tuán)隊(duì)采用EGFP和DsRED熒光對(duì)，構(gòu)建了基于FRET的分子傳感器EGFP-SNAP25-DsRED，專用于檢測(cè)肉毒毒素（BoNT/A）的內(nèi)切酶活性。當(dāng)BoNT/A切割SNAP-25連接蛋白后，熒光供體與受體的距離發(fā)生變化，導(dǎo)致FRET信號(hào)顯著降低或消失，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)毒素活性的快速檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)表明，該分子傳感器在毒素濃度范圍從7.8 U到125 U內(nèi)具有良好的線性響應(yīng)，靈敏度可達(dá)4 U。同時(shí)，該研究通過(guò)優(yōu)化緩沖液、溫度及反應(yīng)時(shí)間，確保了檢測(cè)過(guò)程的高精確性與重復(fù)性（圖2）。    
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圖2 基于FRET的分子傳感器BoNT/A活性檢測(cè)驗(yàn)證
在此基礎(chǔ)上，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步開發(fā)了基于FRET的細(xì)胞傳感器。通過(guò)在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（Neuro-2a）中穩(wěn)定表達(dá)EGFP-SNAP25-tDimer2，采用共聚焦成像技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)BoNT/A中毒全過(guò)程的監(jiān)測(cè)。該體系靈敏度可達(dá)100 pM，并能夠量化從3.125 nM到50 nM的毒素濃度變化，特異性強(qiáng)。
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圖3 基于FRET的細(xì)胞傳感器BoNT/A活性檢測(cè)驗(yàn)證

該研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)的雙層次的FRET檢測(cè)體系具有多方面的應(yīng)用潛力，一方面，分子傳感器為快速篩查食品、環(huán)境樣本中的肉毒毒素污染提供了高效工具；另一方面，細(xì)胞傳感器能夠?yàn)楣I(yè)生產(chǎn)中毒素活性檢測(cè)和解毒劑研發(fā)提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持。該研究提供了快速、無(wú)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的肉毒毒素檢測(cè)替代方案，尤其在檢測(cè)效率、操作簡(jiǎn)便性及結(jié)果穩(wěn)定性方面表現(xiàn)出顯著優(yōu)勢(shì)，為肉毒毒素檢測(cè)開辟了新的方向。未來(lái)隨著技術(shù)的進(jìn)一步優(yōu)化，這一體系有望推廣至更多毒素檢測(cè)和生物功能研究中，為公共衛(wèi)生、食品安全和工業(yè)生產(chǎn)提供更加完善的解決方案。

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