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近日，云南大學醫學院尹敏課題組聯合中國科學院昆明植物研究所黃勝雄研究員課題組，在催化領域知名期刊ACS Catalysis上發表了題為“Uncovering the Parallel Biosynthetic Pathways of the Cyclohexanone and Phenol Rings in Cycloheximide and Actiphenol by Tailoring Redox Enzymes”的研究論文。該研究揭示了苯酚和環己酮在相同生物合成機制下形成的一種罕見且不同的級聯氧化還原機制，涉及由羧酸還原酶和CYP450協同催化PKS產物引發的分子內羥醛縮合反應。這一發現擴展了對天然藥物分子生物合成中氧化還原酶介導的酚和環己酮基團形成的理解，并為未來的組合生物合成新藥研發奠定了基礎。近年來，尹敏研究團隊以云南本地多種中草藥為研究對象，構建了藥用植物內生放線菌庫，通過多組學聯合運用高效發現了系列高潛力菌株，獲得了多個活性新天然產物，進而開展了生物合成機制的研究。

真核細胞翻譯抑制劑放線菌酮（cycloheximide, CHX）及其類似物放線菌酚（actiphenol, APN）都具有特殊的戊二酰亞胺結構和六元碳環側鏈基團。APN與CHX的區別在于其含有芳香酚環而非環己酮基團。在前期的天然產物發現工作中，作者注意到多株產生CHX的菌株能夠同時發現有APN的產生（Highet et al. Helv Chim Acta, 1959；Rao et al. J Org Chem, 1960；Huang et al. J Antibiot, 2011；Liu et al. Front Microbiol,2022）。基于這一現象，作者團隊推測CHX和APN可能通過同一生物合成途徑進行合成（Yin et al. Org Lett, 2014），并提出了后修飾苯環脫芳可能是形成這兩種化合物的關鍵機制。然而，這一假設主要得到了chxG或chxH基因敲除實驗的支持，而缺乏相應的體外實驗證據（圖1B）。此外，由于常溫常壓下苯環難以實現脫芳化，六元碳環的形成機制仍存在不確定性。為了更深入地理解CHX和APN中兩個不同基團的生物合成機制，作者選擇了菌種庫中能同時大量產生這兩種化合物的藥用植物內生放線菌Streptomyces sp. YINM00100作為研究對象，對其生物合成基因簇進行了詳細分析（圖1A）。研究發現，四種后修飾酶：烯酰還原酶（ChxG）、酮還原酶（ChxH）、細胞色素P450 (ChxI）和三結構域羧酸還原酶（ChxJ）可能參與新生聚酮中間體3的后修飾（圖1B）。

圖1：(A) chx和chx- YINM00100 BGC的基因簇比較。(B)前期研究提出的CHX和APN的生物合成途徑。(C)由化合物7化學合成化合物3和8

在先前的研究中，作者通過體內敲除chxE、chxJ、chxI、chxG和chxH基因來探究它們在生物合成途徑中的作用。除了ChxH外，其他三種酶的體外功能尚未確定。在本研究中，作者構建了chxJ、chxI和chxG基因敲除突變株，證明了chxJ和chxI在CHX和APN的生物合成中都起著重要作用，此外，菌株YINM00100的基因組中可能存在一個類似的基因可以補償chxG的功能（圖2A）。通過大規模發酵菌株Streptomyces himastatinicus ATCC 53653獲得了足量的9-methylstreptimidone（化合物7），并通過化學合成得到了化合物3（圖1C）。接下來通過酶學實驗證明ChxJ能夠以3為底物，以ATP和NADPH為輔助因子生成化合物8。用氧化劑DMP處理了中間體8，大部分底物轉化為APN，但沒有轉化為中間體5，這表明8中的C-8羥基氧化導致自發環化，然后芳構化生成APN（圖2B）。綜上得出，ChxJ的A結構域激活并加載3到ACP上，接著ChxI將3-S-ACP中的C-8羥基氧化，最后由ChxJ的R結構域還原硫酯鍵獲得化合物4，最后通過自發地分子內羥醛縮合和脫水芳構化形成APN（圖2C和1B）。

圖2：(A)野生型和突變株的HPLC圖譜。 (B) (iv) ChxJ與3孵育。 (C) ChxJ和ChxI與3孵育。

ChxJ和ChxI的組合足以產生APN，而ChxH和ChxG對于CHX的生物合成至關重要，這與作者早期的體內敲除實驗結果一致。ChxH負責CHX生物合成途徑的最后一步已經在先前報道的文章中證實，接下來重點研究ChxG。實驗結果顯示，化合物8能被ChxG還原為化合物9（圖3A），這表明ChxG在CHX生物合成中的作用是介導不穩定的醛化合物4的C12-C13雙鍵還原，生成新的中間體10，該中間體隨后可自發進行醛醇縮合脫水生成11（圖3B、圖4）。隨后將ChxJ、ChxI和ChxG組合在一起，以3為底物進行了一鍋反應，證明了化合物4是ChxG的真實底物（圖3C）。而化合物11可以在非酶催化條件下轉化為化合物6（圖3D）。此外，找到了一個ChxG的同源蛋白，并通過體外實驗驗證了其具有ChxG相同的活性。驗證了ChxG在底物還原過程中的立體選擇性與天然放線菌酮生物合成過程中C12和C13雙鍵還原時的立體選擇性是一致的（圖5A）。最后，通過分子模擬對接分析以及后續點突變蛋白的構建，證明了氨基酸H162、H165和Y167對ChxG的還原活性起著至關重要的作用（圖5B）。

圖3：ChxG的體外酶促反應。(A)

ChxG化合物8生成9。 (B）由化合物1（CHX）化學合成化合物11和6。（C) ChxI、ChxJ和ChxG與3孵育，11易于發生酮烯醇互變異構生成11a。（D） NADPH在添加或不添加ChxG的情況下分別與11共孵育。

圖4：新推導的CHX和APN的生物合成途徑。

圖5：(A) 手性HPLC圖譜。 (B)化合物8與ChxG活性口袋對接。

至此，CHX和APN的生物合成途徑的細節，包括六元碳環系統的生物合成的新機制得到了完整解析。本研究表明，CHX和APN并非如先前推測的那樣由APN催化氫化產生CHX，而是自trans-AT PKS合成了碳骨架后，通過兩個平行的途徑分別產生的。兩種氧化還原酶（ChxJ和ChxI）可以單獨產生一種活性中間體，該中間體經歷一系列非酶轉化以產生APN，而還原酶（ChxG）則作為看門人，將同一中間體引導到產生CHX的合成途徑。該研究對作者團隊于2014年提出的假設（Yin et al. Org Lett, 2014）進行了進一步修正，擴展了對天然產物生物合成中氧化還原酶介導的酚和環己酮基團形成的理解，并為未來的組合生物合成研究奠定了基礎。

云南大學醫學院尹敏副研究員和中國科學院昆明植物研究所黃勝雄研究員、顏一軍研究員為文章共同通訊作者。上述工作得到了國家自然科學基金（82225043、 32271523 、82160674），中國科學院戰略生物資源計劃（KFJBRP-009-005）和云南省自然科學基金（202201AS070007）等項目的支持。
原文鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscatal.4c03332