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2008年，Blackman等人報道了基于逆電子需求Diels-Alder（iEDDA）的四嗪（Tz）和反式-環辛烯（TCO）的生物正交反應。該反應中Tz分子因其獨特的化學結構而表現出對生物分子良好的標記、追蹤和特異性識別能力。如Figure 1A所示，目前第一代Tz耦合熒光染料的探針體系的設計思路仍是基于F?rster共振能量轉移（FRET）或者跨鍵能量轉移（TBET）。然而，以上探針則表現出在紅光和近紅外波段重疊效果不好和FRET效率低等不足。此外，最近有文獻報道Dexter能量轉移策略在一定程度上能解決FRET和TBET機制帶來的問題，即能夠使紅光/近紅外發射的Tz探針的熒光增強（Figure 1B）。下載化學加APP到你手機，更加方便，更多收獲。

本文中，Tz探針與BODIPY熒光團結合后得到了單發色團型的暗態熒光探針（Figure 1C）。BODIPY-Tz探針在與BCN結合后展現出熒光增強特性，發射波長范圍為520-650 nm。作者還證明了該系列探針可用于活細胞中對不同細胞器的熒光生物成像。基于BCN和TCO的獨特結構，BODIPY-Tz展現出獨特的熒光響應特性并以此實現了對不同細胞器的雙色成像。

BODIPY染料具有α, β和中間位置取代位點 (Figure 2)，有關對BODIPY染料β位進行取代的報道較少。本文中，作者對其α和β位進行Tz分子的修飾，從而得到了BODIPY-Tz探針。基于此，作者合成了一系列BODIPY-Tz分子1-10。

接下來，作者研究了BODIPY-Tz分子的光物理性質。所有的BODIPY-Tz分子在TCO的水溶液中沒有表現出熒光“開啟”的現象。相反，除了分子6以外其他的BODIPY-Tz化合物的熒光增強（Figure 3A-B）。基于單發色團設計策略，所制備得到的BODIPY-Tz探針具有良好的熒光開關比，發射波長范圍覆蓋綠光到遠紅外范圍（Figure 3C）。

由于S₀-S₁的光學禁阻躍遷，單發色團型BODIPY-Tz探針的熒光被淬滅。Tz分子的非輻射能量衰減過程使得BODIPY-Tz具備有效的暗態淬滅特性。為了進一步了解化合物的暗態淬滅效率，作者計算了BODIPY-Tz探針的振子強度（f）。如Figure 4A-C所示，分子的f值均小于0.005，可忽略不計，因而S₀-S₁的分子軌道躍遷主要以π→π*為主。此外，分子與BCN的結合物的能級差與理論計算的發射波長數值呈現線性關系（Figure 4D）。因此，理論計算結果與實驗數據一致。

（圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.）

作者用BODIPY-Tz探針3，4和10與商用線粒體靶向染料共染HeLa細胞。在未清洗細胞的情況下，探針3，4和10可分別實現綠光/紅光/遠紅外通道成像（Figure 5A-C），皮爾森系數均大于0.9，共定位效果良好。同時，探針4和10的熒光強度更是大于商用線粒體染料（Figure 5D-E）。此外，BODIPY-Tz探針5或者10還能夠對溶酶體分別進行紅光和遠紅外成像，具有優秀的溶酶體靶向能力（Figure 5F-G）。

（圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.）

接下來，作者對Tz和BCN之間是否發生了生物正交反應并產生了具有熒光特性的BODIPY-Tz-BCN結合物進行了驗證。Tz和TCO發生iEDDA反應的主要產物含有1,4-或4,5-二氫吡啶環（Figure 6A）。從圖Figure 6B中可以看出所有BODIPY-Tz在與TCO發生iEDDA反應后的熒光增強程度不明顯。最后，作者還證明了BODIPY-Tz-BCN結合物誘導了光致電子轉移過程（PeT）使得熒光淬滅（Figure 6C-D）。

（圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.）

最后，作者研究了BODIPY-Tz-TCO結合物中二氫吡啶結構對熒光淬滅的影響。從4-TCO結合物在不同溶劑中的熒光光譜可以看出（Figure 7A），隨著溶劑極性的降低，4-TCO的熒光量子產率和熒光強度均有增加。相比于4-BCN，4-TCO在甲苯溶液中的光譜發生了移動（Figure 7B）,與實驗結果一致。以上結果表明BODIPY-Tz探針的熒光性能是源于其與BCN結合物中的吡啶基團，而BODIPY-Tz探針與TCO的結合物中含有二氫吡啶基團，因此在極性或者水環境中由于PeT過程而熒光減弱。當用探針5對HeLa細胞染色后，可以得到對溶酶體和線粒體的雙色成像（Figure 7C），并且熒光信號可以被很好地區分，不存在光譜串擾的問題（Figure 7D-E）。