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Nat. Chem.：新型聚次甲基染料的普適性合成策略

來源：化學加原創      2023-12-15
導讀：近日，瑞士蘇黎世大學Pablo Rivera-Fuentes教授在設計合成發光的聚次甲基染料方面取得新進展，相關研究成果以“A general strategy to develop fluorogenic polymethine dyes for bioimaging”為題發表在Nature Chemistry上。本文報道了一種利用分子內關環反應改造聚次甲基染料熒光性能的普適策略，由此開發出了具有自發閃爍和免洗特性的可見-近紅外發光的聚次甲基染料探針。通過將其與自標記蛋白和小分子靶向基團相連，該染料可以與基于羅丹明的染料組合用于多色和熒光壽命多重成像。該工作為發展明亮的長波長發射特性的熒光染料提供了設計指導。文章鏈接DOI: 10.1038/s41557-023-01367-y。

正文

熒光成像技術要求探針具有明亮的發射和良好的光學穩定性。目前基于羅丹明染料骨架的熒光探針占主導地位。但是，發展激發波長和發射波長均在近紅外區間的羅丹明染料也面臨著合成過程復雜、反應時間長和產率低等不足。此外，聚次甲基染料也是最常用的染料之一，但是目前關于提升聚次甲基染料的熒光性能并用于活細胞靶向成像的文章鮮有報道。與羅丹明染料結構不同的是，親核試劑的加入可以大幅改善聚次甲基染料的熒光性能。盡管如此，強發光的聚次甲基染料的發展仍存在著合成困難、反應機制不清晰等缺陷。下載化學加APP到你手機，更加方便，更多收獲。
目前已有的文獻中報道的大多為5-endo-trig型環化后的聚次甲基熒光染料。該環化類型涉及五元環的形成（Fig.1a）。同時，6-endo-trig型的環化異構體也不是很穩定。基于此，作者認為在破壞雙鍵后在環體系中形成單鍵也許是一個有效的合成策略（Fig.1b）。作者使用了密度泛函理論（DFT）計算發生了有效的5-endo-trig型環化得HMSiR（1）染料的開/閉環能量，并將其分別與Cy5的衍生物2，3和4a染料進行對比（Fig.1c, d）。對比之下，經歷了5-endo-trig型環化的Cy5衍生物4a所需的開/閉環能量要小于HMSiR（1）染料（Fig.1c, f）。此外，在Cy5染料上修飾吸電子基團可以提高關環異構體的穩定性。以上數據表明通過5-endo-trig型環化過程可以得到更穩定的聚次甲基熒光染料。
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Fig. 1 碳菁與HMSiR的分子內環化反應

（圖片來源：Nat. Chem.）

接下來，作者又合成了含吲哚基團的骨架5，6，7a-d和橋聯基團8，又經過兩步合成得到了5-endo-trig型Cy5衍生物2a和2b。同時，5-exo-trig型Cy5衍生物4a和4b可以經甲基酯中間體和LiAlH4還原兩步合成得到（Fig.2a）。為了評價關環異構體的穩定性，作者對Cy5衍生物進行了pH滴定（Fig.2b）。實驗結果表明5-endo-trig型探針游離在細胞中能夠表現出明亮的發光，而5-exo-trig型探針在酸性環境中才會發光。在活細胞成像中，5-endo-trig型探針2a和2b在線粒體中表現出明亮的熒光（Fig.2c）。此外，作者合成了靶向性探針11（Fig.2d）。該染料的吸光度增加了約10倍，當與純化的SNAP-tag蛋白培育后其熒光強度提升了21倍（Fig.2e），由此可證明在與自標記標簽蛋白結合后染料的熒光性能增強。后續的實驗表明探針11還具有自發閃爍特性，從而可被用于對細胞微管結構的單分子超分辨成像當中（Fig.2f）。

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Fig. 2 5-endo-trig 和5-exo-trig Cy5衍生物的合成和性能研究

（圖片來源：Nat. Chem.）

作者又利用5-endo-trig策略合成含吲哚基團的化合物13和Cy5探針14（Fig.3a）。將含炔的衍生物與芐基鳥嘌呤10進行偶聯后可得探針15和16（Fig.3b）。染料15與純化后的SNAP-tag蛋白培育后吸光度增強了19倍，熒光強度增強了19倍。對比之下，染料16的吸光度和熒光強度分別提高了1.4倍和2.5倍（Fig.3c），探針15則與JF646系列染料的熒光性能相當。此外，作者驗證了染料15、16和JF646是否可以作為免洗探針用于活細胞成像。熒光成像結果表明探針15和JF646的表現相當（Fig.3d）。作者還制備了肌動蛋白靶向的探針17-actin和DNA靶向探針18-DNA（Fig.3e, f）。體外實驗中，探針17與肌動蛋白結合后的吸光度增加了11倍，熒光強度提升了313倍。活細胞成像中探針17更是能選擇性靶向HeLa細胞中的肌動蛋白。同時，探針18與DNA結合后的吸光度增加了7倍，熒光強度提升了32倍。以上結果表明經5-endo-trig策略合成的Cy5衍生物可進行多種靶向性修飾后用于生物成像。

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Fig. 3 Cy5衍生物的合成、體外和活細胞染色評價

（圖片來源：Nat. Chem.）

最后，作者合成了Cy3的衍生物19和Cy7的衍生物20用于標記SNAP-tag（Fig.4a），探針19和20在與該蛋白結合后吸光度分別提升了6倍和11倍，熒光強度分別增加了28倍和124倍（Fig.4b）。此外，探針15，19和20的發射光譜覆蓋一部分可見光區并延伸到了近紅外區域。在與SNAP-tag結合后探針15和20表現出明亮的發光和良好的光學穩定性（Fig.4c, d）。此外，作者結合使用Cy5染料15和JF549-Halo染料用于多路復合成像當中（Fig.4e）。如Fig.4e 所示，Cy3衍生物19和JF549-Halo的激發和發射波長范圍相近，作者利用其激發態壽命的差異對其進行了熒光壽命成像（FLIM）。成像結果表明盡管兩種探針的波長相近，但是基于染料19（激發態壽命2 ns）和染料JF549-Halo（激發態壽命4 ns）壽命的不同，仍可以對其發光信號進行分離（Fig.4f, g）。

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Fig.4  Cy3和Cy7衍生物的合成、體外和活細胞染色評價

（圖片來源：Nat. Chem.）

總結

瑞士蘇黎世大學Pablo Rivera-Fuentes教授報道了一種利用5-exo-trig關環反應賦予聚次甲基染料熒光特性的普適性合成策略。該染料可通過高產率的兩步反應進行合成，通過改變吲哚基團或者關環基團可得到一系列衍生物。基于該策略改造后的染料表現出更加明亮的長波長發射。此外，該染料還可作為免洗探針用于共聚焦成像和單分子定位顯微成像。同時，與羅丹明探針配合使用還可以實現多色熒光成像和多重熒光壽命成像。該研究為染料的設計改造和新型熒光成像拓寬了思路。

文獻詳情：

Annabell Martin, Pablo Rivera-Fuentes*. A general strategy to develop fluorogenic polymethine dyes for bioimaging. Nat. Chem. 2023, https://doi.org/10.1038/s41557-023-01367-y

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