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JACS：新型紅光吸收染料用于成像和傳感

來源：化學加原創      2023-11-09
導讀：近日，霍華德休斯醫學院Luke D. Lavis教授在合成具有紅光吸收的染料方面取得新進展，相關研究成果以“Optimized Red-Absorbing Dyes for Imaging and Sensing”為題發表在Journal of the American Chemical Society上。本文報道了羅丹明染料的新穎合成方法，以此闡明調節內酯-兩性離子平衡常數（KL?Z）的結構-活性關系。作者發現助色團取代基能夠顯著影響內酯-兩性離子平衡，為改進羅丹明染料的合理設計提供了路線圖。供電子助色劑（如久洛定)）與氟化苯環協同作用，產生明亮的紅移熒光團，用于活細胞單粒子追蹤（SPT）和多色成像。N-芳基助色劑與氟化相結合產生紅移福斯特共振能量轉移（FRET）淬滅染料，可用于創建新的半合成指示劑，以使用熒光壽命成像顯微鏡（FLIM）檢測環磷酸腺昔（cAMP）。該工作拓寬了羅丹明染料的合成新路線，為先進熒光成像技術發明了新探針，為闡明化合物的結構-活性關系提供了指導。文章鏈接DOI: 10.1021/jacs.3c05273。

正文

羅丹明染料具有優異的光物理性能、結構-性質可調性以及良好的生物性而被廣泛應用于生物靶向和熒光標記等領域。羅丹明染料結構中存在著親脂性內酯（L）和兩性離子（Z）平衡。通過確定KL-Z的平衡常數可以優化羅丹明染料的生物性能（Figure 1a）。近期研究表明苯環的氟化可以提升含氮雜環丁烷羅丹明染料的KL-Z。此外，作者還發現氟化苯環可以更簡便地合成羅丹明染料衍生物，該方法中采用了含甲氧基甲基醚（MOM）保護基的2-羥基丙二腈MAC試劑（Figure 1b）。作者通過調研羅丹明染料的合成路線，進而發展了制備氟化羅丹明的新方法。通過修飾不同的助色團取代基，能夠顯著影響內酯-兩性離子平衡，并進一步影響化合物性質。最后，所制備的染料還被成功證明可用于先進光學成像當中。下載化學加APP到你手機，更加方便，更多收獲。

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Figure 1. KL-Z氟化合成羅丹明染料衍生物：（a）JF646和JF669的內酯-兩性離子平衡；（b）使用MAC試劑合成功能化氟化羅丹明染料。
（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

作者考察了在二氧六環-和水的體系中不同染料內部的內酯-兩性離子平衡（Figure 2）。實驗數據表明氟化過程一般會增大KL-Z，該常數與染料結構中的橋聯取代基團密切相關。因此，根據助色團的給電子能力大小（NH2 < azetidine < pyrrolidine <tetrahydroquinoline < julolidine），SiRh110和 JF646  的KL-Z ~ 10?3, JFX650 和SiRhQ的 KL-Z ~ 10?2, 含 julolidine 基團的SiRh101的KL-Z ~1。

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Figure 2.助色團類型和氟化對KL-Z的影響 
（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

接下來，作者選擇三種氟化染料進行后續的生物成像應用研究。作為ATTO 647N（115，Figure 3a）染料的氟化類似物，carborhodamine 59與其進行了對比實驗。ATTO 647N-HaloTag用于活細胞成像時，并未實現對細胞核的顯著標記（Figure 3b），而這也歸因于陽離子羅丹明染料的衍生物更傾向于聚集在活細胞中的線粒體上。作者將染料59HTL與表達組蛋白H2B?HaloTag融合蛋白的細胞進行培養，從圖中可以看出59HTL對細胞核的染色效果良好（Figure 3c）。此外，作者還比較了59HTL和89HTL在單顆粒示蹤（SPT）實驗中的成像性能表現（Figure 3d）。從Figure 3e中可以看出，59HTL的亮度較高（Figure 3e）。同時，89HTL隨著成像時間的延長，光漂白的速度較快（Figure 3f）。

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Figure 3. JF657的性質表征：（a）染料105、105HTL和59HTL的化學結構；（b, c）105HTL和59HTL 染色U2OS細胞的熒光圖像；（d）染料89HTL的化學結構；（e）89HTL和59HTL在SPT實驗中的強度比較；（f）89HTL和59HTL在SPT實驗中的局部區域的定位圖。
（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

近紅外窗口具有背景熒光干擾性小、低散射、相對較大的組織穿透深度等優點。作者對比了31HTL和包括31HTL、38HTL等在內的近紅外熒光探針的光學性能（Figure 4a）。通過調整合成方法進而得到近紅外激發的染料110（Figure 4b）。作者繼續測試了該染料在活細胞標記成像當中的實用性。所有的化合物都可以與表達HaloTag的活細胞同時進行靶向，然而在相同激發波長下，31HTL展現出更高的熒光強度（Figure 4c）。同時，相較于107HTL和106HTL，31HTL展現出良好的光學穩定性和更高的亮度，因而可以實現多色成像（Figure 4d）。

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Figure 4. 近紅外激發熒光團的性能評價：（a）31HTL、36HTL、38HTL、108HTL、106HTL和108HTL的化學結構；（b）104HTL的合成；（c）不同染料染色細胞核的強度值比較；（d）U2OS細胞的多色成像。
（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

最后，分子 65HTL與HaloTag 蛋白進行孵育后的吸光度提升了47倍（Figure 5a, b）。作者將遠紅外淬滅染料作為半合成傳感器用于標記cAMP。染料與cAMP結合后的構象發生改變，從而削弱FRET過程，使得受體的熒光壽命提高（Figure 5c, d）。FRET過程的構建是以65HTL作為受體，88STL作為給體。基于熒光壽命顯微鏡（FLIM），實驗數據表明細胞的壽命為 2.34 ± 0.10 ns（Figure 5d, e）。該數據顯著低于只用JFX612給體標記的細胞壽命（4.30 ± 0.01 ns），由此表明JQ645-HaloTag是FRET過程的淬滅劑。此外，使用forskolin（腺苷酸環化酶激活劑）增加細胞內cAMP的濃度后會使染料分子的壽命提高至3.32 ± 0.18 ns，證明JQ645-HaloTag可被用作為自標記探針檢測細胞內標志物。

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Figure 5. 半合成cAMP：（a）91HTL和65HTL的化學結構；（b）不同染料的吸收光譜；（c）半合成cAMP的合成路線示意圖；（d）U2OS細胞的熒光壽命圖像；（e）ScAMPI的熒光壽命。
（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

總結

霍華德休斯醫學院Luke D. Lavis教授改進了羅丹明染料的合成方法，建立了氟化羅丹明的設計路線。實驗數據還揭示了調節內酯-兩性離子平衡常數的結構-活性關系。此外，所設計的分子還被成功應用到活細胞的FLIM成像當中。該工作為合成新型熒光染料提供了指導，推動了小分子熒光標記染料在先進光學成像領域的發展。

文獻詳情：

Jonathan B. Grimm, Ariana N. Tkachuk, Ronak Patel, S. Thomas Hennigan, Alina Gutu, Peng Dong,Valentina Gandin, Anastasia M. Osowski, Katie L. Holland, Zhe J. Liu, Timothy A. Brown, Luke D. Lavis*. Optimized Red-Absorbing Dyes for Imaging and Sensing. J. Am. Chem. Soc. 2023, https://doi.org/10.1021/jacs.3c05273

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