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　　病毒蛋白酶是抗病毒藥物研發的重要靶標，在新冠病毒出現之前，已有數十個HCV、HIV蛋白酶抑制劑先后獲批上市，用于病毒感染治療。因此，尋找新冠病毒3CL蛋白酶小分子抑制劑是抗新冠病毒藥物研發的一個重要途徑。新冠疫情初期，研究團隊發現已上市可口服HCV蛋白酶抑制劑博賽潑維（boceprevir）能夠抑制新冠病毒3CL蛋白酶活性（IC50 = 8596 nM），于是根據它與新冠病毒3CL蛋白酶的復合物晶體結構，對其P1’-P4基團系統開展了藥物設計與優化工作（圖1）。

　　根據博賽潑維與新冠病毒3CL蛋白酶的結合模式，研究人員以谷氨酰胺的常見模擬結構丁內酰胺替換疏水性的環丁烷，作為極性的P1基團以提高其與蛋白酶極性的S1位點的匹配度；為了與“氧陰離子空穴（oxyanion hole）”形成氫鍵相互作用，針對P1’基團探索了尺寸較小的α,β-不飽和酮、醛和氰基等包含N或O原子的共價彈頭時的活性情況（圖1）。GSH反應性測定發現以氰基為彈頭的化合物2的共價反應活性最低（t1/2 = 962 min），且該化合物在Vero E6細胞上對新冠病毒復制的抑制活性（EC50）可高達319 nM。

　　隨后，研究團隊通過解析化合物2與新冠病毒3CL蛋白酶的復合物晶體結構，發現其P2基團未能充分占據疏水的S2位點，因而針對此位點嘗試了更大的疏水基團，結果發現P2基團為二硫戊烷螺環取代的脯氨酸（dithiaspiro-proline）時，化合物7與蛋白酶的親和力和抗病毒活性均有所提高（圖1）。P3基團朝向溶劑區，與蛋白酶無明顯相互作用，因而未對該基團進行結構優化（圖1）。針對P4基團開展優化的過程中，最終發現引入三氟乙酰基的化合物9（SIM0417/SSD8432/simnotrelvir/先諾特韋）具有更強的3CL蛋白酶抑制活性（IC50 = 9 nM）及細胞水平對新冠病毒WIV04、Delta及Omicron毒株復制的抑制活性（EC50 = 26 nM、34 nM及43 nM）。

　　由于3CL蛋白酶在冠狀病毒尤其是新冠病毒中高度保守，先諾特韋對目前已知的多個新冠病毒變異株的3CL蛋白酶，保持相同水平的抑制活性，提示其對新冠病毒的不同突變株具有廣譜的抗病毒活性。先諾特韋對SARS-CoV和MERS-CoV等其它6種可感染人的冠狀病毒3CL蛋白酶也有強抑制活性，提示其作為廣譜的抗冠狀病毒藥物使用的潛力。進一步研究發現，先諾特韋聯合利托那韋在小鼠和食蟹猴體內具有良好的口服藥代性質，口服先諾特韋（200 mg/kg，BID）和利托那韋（50 mg/kg，BID）可有效抑制Delta毒株感染的轉基因小鼠肺部和腦部的病毒復制，顯著減輕病毒感染引起的肺部損傷，在損傷保護方面顯著優于奈瑪特韋（圖2）。

　　先諾特韋具有良好的安全性。先諾特韋對6種人體蛋白酶、413種激酶、7個CYP酶及47個藥品不良反應潛在靶點等均具有很好的選擇性；體內外安全性評價試驗中，未發現遺傳學毒性。實驗表明，先諾特韋在酶和細胞水平，以及動物體內抗病毒藥效方面均與奈瑪特韋相當，但先諾特韋顯示了較好的血腦屏障穿透能力，在更低的給藥劑量下（50 mg/kg）即可完全清除小鼠腦部病毒。已有大量研究表明，新冠病毒會造成海馬體損傷，引起味覺、嗅覺障礙等中樞神經損傷，先諾特韋在腦部病毒清除的優勢，提示其可在人體上實現更好的腦部損傷保護作用。

　　值得一提的是，這是第一次將含有二硫戊烷螺環取代的脯氨酸基團（即P2基團）用于蛋白酶抑制劑的研發，且該基團在上市藥物中非常罕見，因此先諾特韋的研發為該結構片段用于新藥創制提供了一個成功范例。復合物晶體結構顯示，相比于奈瑪特韋的P2基團，先諾特韋的P2基團體積更大，與3CL蛋白酶形成了更多的相互作用，熱力學研究也發現先諾特韋與新冠病毒3CL蛋白酶的結合焓優于奈瑪特韋（圖3）

　　2021年11月，上海藥物所、武漢病毒所與先聲藥業達成合作，全速推進先諾特韋的后續研發工作。2023年1月29日，先諾特韋片/利托那韋片組合包裝（商品名稱：先諾欣）獲得國家藥監局附條件批準上市，用于輕中度成年患者新冠病毒感染的治療，成為國內首款上市的口服3CL蛋白酶抑制劑（圖4）。目前，先諾欣?已覆蓋全國32個省、306個市及超2500家醫療機構，以每月數百萬人份的藥品的可及能力，為新冠病毒常態化防控提供重要保障。

　　上海藥物所許葉春研究員、沈敬山研究員、武漢病毒所張磊砢研究員以及先聲藥業唐任宏博士為本研究論文的共同通訊作者。上海藥物所蔣翔銳研究員、蘇海霞副研究員、張巖助理研究員、趙文峰博士、武漢病毒所尚衛娟實驗師及先聲藥業周峰博士為本研究論文的共同第一作者。該研究工作得到了上海藥物所藥物安全評價研究中心和藥物代謝研究中心、上海同步輻射光源的支持及國家自然基金、上海市科委、上海藥物所、武漢病毒所和臨港實驗室的經費資助。

　　全文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41467-023-42102-y

圖1. 先諾特韋的理性設計與優化過程

圖2. 先諾特韋的小鼠體內藥效評價

圖3. 先諾特韋（a）和奈瑪特韋（b）的P2基團與新冠病毒3CL蛋白酶的相互作用和結合熱力學參數（c）

圖4. 抗新冠病毒感染口服新藥——先諾欣?