Nature發文！生物醫學研究院羅敏/盧智剛/高海合作團隊報道腫瘤免疫治療新靶點

2023年9月6日，復旦大學生物醫學研究院羅敏/盧智剛/高海合作團隊和中國科學院分子細胞科學卓越創新中心趙允團隊合作在《自然》（Nature）雜志在線發表題為CD300ld on neutrophils is required for tumour-driven immune suppression的研究文章。該研究發現一個全新的、功能高度保守的腫瘤免疫抑制受體CD300ld。CD300ld在PMN-MDSCs上特異性高表達，是調控PMN-MDSCs募集及免疫抑制功能的關鍵受體。靶向CD300ld能夠通過抑制 PMN-MDSCs的募集和功能，重塑腫瘤免疫微環境，從而產生廣譜抗腫瘤效果。CD300ld靶點顯示出很好的安全性、保守性，抗腫瘤有效性、及與PD1 靶點的協同性，有望成為腫瘤免疫治療新的理想靶點。

以PD-1/PD-L1/CTLA-4等分子為代表的免疫檢查點阻斷（ICB）療法是近年來在腫瘤治療領域中的革命性進展。然而，現有ICB在不同腫瘤病人當中的效果差異很大，相當比例的患者無應答，長期獲益比例更低。腫瘤免疫微環境含有大量抑制免疫的髓系細胞群體，在腫瘤發展和治療耐受中發揮關鍵作用，是現有免疫治療的嚴重阻礙。

病理性激活的中性粒細胞（也被稱為多形核髓系來源的抑制細胞：Polymorphonuclear myeloid derived suppressor cells, PMN-MDSCs）是免疫抑制微環境的重要組成細胞。與正常的中性粒細胞不同，PMN-MDSCs具有強烈抑制淋巴細胞殺傷的作用，通過多種途徑參與腫瘤進展。尋找針對PMN-MDSCs的特異性靶點來調控腫瘤免疫微環境是當前免疫治療的焦點和挑戰。

作為機體的第一道防線，中性粒細胞在天然免疫中發揮著重要作用，但由于中性粒細胞本身半衰期短且成熟后無法繼續增殖的特性，對于此類細胞研究落后于其他先天性和適應性免疫細胞。隨著近年來技術的進步，中性粒細胞在生理及病理狀態下的復雜性和異質性開始被人們所理解，其在癌癥中扮演的角色也越來越受到大家的關注。諸多的臨床證據也表明了中性粒細胞深度參與腫瘤進展，并與病人預后顯著相關，因此探究中性粒細胞在腫瘤進展中的作用、尋找針對這群細胞的特異性靶點具有十分重要的臨床意義。

聚焦這一科學問題，本文研究人員首先以髓系細胞偏向表達的系列膜蛋白為對象，利用小鼠腫瘤模型進行CRISPR-Cas9體內篩選，發現缺失CD300ld的免疫細胞在腫瘤中缺失最為顯著，提示表達CD300ld的細胞可能促進腫瘤發展。CD300ld在中性粒細胞中特異性高表達、并在荷瘤之后表達顯著上調。隨后研究者構建CD300ld敲除小鼠，證實CD300ld缺失顯著抑制多種繼發性及原發性腫瘤模型的發展；同時CD300ld敲除對小鼠的正常發育以及免疫系統發育無顯著影響。通過骨髓移植、構建多種條件性敲除小鼠、以及清除體內PMN-MDSCs等多種手段，結果證實CD300ld通過PMN-MDSCs調控腫瘤發展。因此，CD300ld作為中性粒細胞/PMN-MDSCs表面標志物，是PMN-MDSCs促進腫瘤發展的關鍵功能受體。

為研究CD300ld調控腫瘤免疫的機制，研究者首先分析CD300ld缺失對腫瘤微環境的影響。CD300ld缺失導致PMN-MDSCs在腫瘤中的募集大幅降低，同時伴隨CD8+ T細胞浸潤顯著上升。單細胞轉錄組分析顯示，大部分促腫瘤細胞群體在比例及抑制免疫信號通路上明顯下調，而抗腫瘤細胞群體在比例及相應信號通路上則顯著上升。因此，CD300ld缺失能夠重塑腫瘤免疫微環境，將其由免疫抑制狀態轉為免疫活化狀態。這也進一步體現出PMN-MDSCs在腫瘤免疫微環境建立上的關鍵作用。

PMN-MDSCs的兩個特性是其促進腫瘤進展的關鍵因素：向腫瘤募集的能力、和高度抑制免疫效應細胞的能力。CD300ld同時調控PMN-MDSCs的這兩種功能。CD300ld缺失的PMN-MDSCs表現出更弱的遷移能力和向腫瘤中募集的能力；同時，其抑制T細胞增殖的能力也顯著下降。進一步分析表明，S100A8/A9是CD300ld下游的關鍵效應分子。CD300ld通過激活STAT3，上調S100A8/A9的表達，形成CD300ld-STAT3-S100A8/A9軸，從而調控PMN-MDSCs的募集與免疫抑制功能。

隨后研究者探究在腫瘤形成之后再去阻斷CD300ld是否仍具有抗腫瘤效果。結果顯示，在腫瘤已建成后，利用藥物條件性敲除CD300ld仍然能夠顯著抑制腫瘤發展；研究者進一步通過注射CD300ld胞外區蛋白來競爭性抑制CD300ld，也能夠顯著抑制各種繼發性和原發性腫瘤的進展。阻斷CD300ld與PD-1抗體產生更好的聯合治療效果。因此，阻斷CD300ld體現出很好的抗腫瘤治療潛力，并與現有ICB治療能夠產生顯著協同。

為進一步研究人CD300ld的同功性，研究者分析了TCGA數據庫以及多例不同類型腫瘤的病人樣本。結果顯示，CD300ld也在人中性粒細胞/PMN-MDSCs上特異性高表達；同時在多種癌種中，CD300LD的表達顯著高于癌旁以及正常組織，并與中性粒細胞的浸潤以及病人預后顯著相關。研究者隨后構建CD300LD人源化小鼠，進一步證明人鼠CD300ld功能同源，競爭性抑制人CD300LD也呈現出顯著抗腫瘤效果。

綜上所述，該項研究發現了PMN-MDSCs表面的關鍵功能受體CD300ld，在腫瘤免疫抑制中發揮重要作用。CD300ld通過STAT3-S100A8/A9軸同時調控PMN-MDSCs的募集及其T細胞抑制功能，從而促進免疫抑制微環境的建立和腫瘤的進展。阻斷CD300ld通過減少PMN-MDSCs的募集并降低其免疫抑制功能，重塑免疫微環境由免疫抑制狀態轉為活化狀態，從而產生廣譜抗腫瘤效果。

中國科學院分子細胞科學卓越創新中心博士后王超雄、復旦大學生物醫學研究院/附屬兒科醫院博士后鄭曦晨、復旦大學生物醫學研究院/附屬第五人民醫院研究助理張金蘭為本文共同第一作者。復旦大學生物醫學研究院/附屬兒科醫院羅敏研究員、中國科學院分子細胞科學卓越創新中心趙允研究員、復旦大學生物醫學研究院/附屬第五人民醫院盧智剛研究員、復旦大學生物醫學研究院/附屬徐匯中心醫院高海研究員為該論文共同通訊作者。

原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41586-023-06511-9

Nature發文！物理學系田傳山課題組實現對懸浮石墨烯電極-水界面本征物理化學性質的調控和光譜表征

近日，物理學系田傳山課題組在電化學界面的原位表征上取得進展。相關成果以“Structure evolution at the gate-tunable suspended graphene-water interface”為題，于2023年8月30日發表在Nature雜志上。

作為主要的電催化劑載體和層狀插層基質，石墨電極在能量轉換和存儲領域有著廣泛應用。與石墨相似，石墨烯作為石墨的二維結構單元，具有獨特的物理和化學性質，為開發先進的能源器件提供了更多的選擇和調節能力。然而，石墨烯很容易受到外界因素的影響，導致之前的研究產生了許多爭議。該研究提出并實現了無污染、懸浮的厘米級尺寸石墨烯電極方案，·從實驗上解決了難以探究石墨（烯）本征性質的困難。通過原位電學測量和非線性光譜分析，獲得了在電化學反應電壓閾值前后，緊鄰電極界面(Stern層)的分子結構信息，并初步追蹤了反應中間體的譜學特征。這項工作不僅展示了無基底的石墨烯對于揭示石墨烯-電極界面的本征微觀結構和微觀反應路徑是必不可少的，而且，為研究電化學界面提供了理想的實驗平臺。

研究人員通過改進的石墨烯剝離工藝，從銅襯底上CVD生長的石墨烯出發，得到了厘米級的無襯底懸浮石墨烯樣品。樣品具有優越的宏觀和微觀特性，不僅缺陷較少，而且機械性能出色。將四根細鉑絲（直徑20 μm）與MLG薄片接觸，實現了對石墨烯費米面和電極電位的調控。研究人員運用了相位敏感的和頻光譜技術，對界面結構進行了深入研究，探索了石墨烯二維電子的非線性光學響應以及電極附近氫鍵網絡結構在電位調控下的變化。實驗獲得的石墨烯和頻光譜與化學勢μ的函數關系與理論計算非常吻合。實驗首次在本征石墨烯-水界面觀測到了O-H懸掛鍵共振峰(dangling O-H)，表明了石墨烯疏水特性。由于O-H懸掛鍵與石墨烯之間的相互作用，dangling O-H模式與空氣-水界面上的對應模式相比，紅移了約100 cm-1，并具有更寬的線寬。

基于該課題組之前發展的非線性光譜分析方法，研究人員發現，在產氫、產氧電壓閾值之間的窗口，雖然和頻光譜展示出了強烈的電壓依賴關系，但定量扣除屏蔽層貢獻后，緊鄰電極的氫鍵網絡（Stern layer）對界面電場幾乎不敏感；僅當柵極電壓接近水的電解閾值時， Stern層的結構開始發生實質性的變化。當進一步調節電壓至略高于析氫反應的閾值，最表層的dangling O-H模式完全消失。這些譜學特征表明，界面電荷轉移引發的析氫反應過程中，中間體和產物在界面開始聚集。研究人員正在解析這些譜學變化蘊含的指紋和結構信息。這為進一步追蹤電化學微觀反應路徑奠定了實驗基礎。

物理學系畢業生徐影博士為論文第一作者；田傳山教授為通訊作者；馬悠博、谷峰同學，以及楊珊珊博士在實驗階段、文章撰寫階段做出了重要貢獻。該工作得到了國家自然科學基金委、科技部的基金項目支持。

圖1 石墨烯-電解質界面。我們將單層石墨烯（MLG）懸浮在由0.1M氯化鉀（KCl）溶液組成的電解質表面。該溶液含有鉀離子、氯離子和水分子。四根鉑導線連接到石墨烯上，用于四電極的電學表征和門電位調控。石墨烯作為工作電極(W)，銀/銀氯化物（Ag/AgCl）作為參比電極(R)，鉑為對電極(C)。非線性光譜學分析方法探測懸浮石墨烯-電解質界面的微觀結構。

論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41586-023-06374-0