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導讀

前列腺癌（PC）是一種發生于前列腺上皮的惡性腫瘤，是老年男性發病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一。雄激素受體（AR）作為前列腺癌治療的重要靶點之一，其持續的下游信號傳導對前列腺癌細胞的生長、存活至關重要。AR結構（圖1）主要由N末端轉錄結構域（NTD）、C末端配體結合結構域（LBD）和中央DNA結合結構域（DBD）組成。AR-V7是一種AR剪切突變體，缺少LBD結構域，在缺乏雄激素的條件下，AR-V7依然能誘導產生非配體依賴的轉錄，具備調節基因表達的活性，因此被認為是剪切突變體中與去勢抵抗性前列腺癌（CRPC）最相關的一種亞型。因此，開發能夠同時靶向AR及AR-V7的小分子藥物是治療常規與耐藥型前列腺癌的一種重要途徑。

近日，國際藥物化學領域TOP期刊 Journal of Medicinal Chemistry （DOI: 10.1021/acs.jmedchem.3c00585）雜志報道中國海洋大學秦沖教授團隊研究成果：提出靶向AT-NTD的PROTAC降解劑策略，設計并合成得到BWA-522可同時降解AR-FL（野生型）與AR-V7，并具有良好的口服效用，有望應用于前列腺癌的治療。

正文

目前靶向AR的藥物（圖1）主要結合于LBD，如氟他胺（1）、比卡魯胺（2）、恩雜魯胺（3）和阿帕魯胺（4）。此外，一些靶向其他AR結構域的拮抗劑也被報道，化合物5可高效靶向AR-DBD，其IC50 ~ 0.1 μM。EPI-002（6）是從海綿中分離出來的雙酚A衍生物，被證明通過結合AR-NTD來阻止AR轉錄活性。其前藥EPI-506（7）于2015年進入I期臨床試驗，但因藥效不足，代謝水平較差，限制了其進一步的臨床試驗。

圖1 AR及突變體蛋白結構與AR拮抗劑的化學結構(圖片來源：J. Med. Chem.)

蛋白水解靶向嵌合體（PROTAC）是另一種有前景的雙功能分子，它通過劫持細胞中泛素-蛋白酶體系統（UPS）來誘導靶蛋白的泛素化，隨后通過蛋白酶體降解（圖2）。雖然許多AR-LBD PROTAC（圖2）已經成功地實現了AR的降解，但這些PROTAC針對AR-V7的降解效力仍然較弱。秦沖教授團隊最近報道的AR拮抗劑-Hsp90抑制劑偶聯物，能同時誘導AR和AR-V7降解，并能夠實現腫瘤靶向性，具備進一步開發為候選藥物的潛力（J. Med. Chem. 2023, 66, 7, 4784–4801. DOI: 10.1021/acs.jmedchem.2c01970）。由于靶向AR-NTD的PROTACs能夠同時結合并降解AR-FL和AR-V7，消除其功能，在治療PC和CRPC中具備臨床價值。 綜上，研究人員開展了首個靶向AR-NTD的PROTAC設計、合成和生物學評價的研究。下載化學加APP到你手機，更加方便，更多收獲。

基于PROTAC分子結構（圖3），研究人員選擇EPI-002作為靶蛋白配體，E3連接酶VHL與CRBN的配體作為招募E3配體，通過不同Linker將兩部分連接。為了在連接結構時不影響配體結合效率，研究人員分析了NTD抑制劑EPI-002的結合方式（圖3），選擇處在溶劑暴露區的丙二醇片段作為接出位點，連接Linker與E3連接酶配體。

圖2 代表性AR PROTAC的化學結構(圖片來源：J. Med. Chem.)

圖3 AR-NTD PROTACs的設計(圖片來源：J. Med. Chem.)

在活性初篩階段，研究人員首先利用Click反應，合成了三個具有不同長度Linker的AR-NTD PROTACs（13-15）。通過Western blotting分析LNCaP和VCaP中AR-FL和AR-V7蛋白水平。結果顯示（表1），化合物13-15在兩種前列腺癌細胞株中，僅能降低17.6-53.5%的AR-FL。

接下來，研究人員將E3連接酶配體換為沙利度胺，設計合成了具有柔性和半剛性Linker的PROTACs（16-24）。降解數據顯示（表2），基于CRBN配體的PROTACs相比于VHL配體對AR-FL與AR-V7的降解活性更高，其中含有半剛性Linker的化合物 24的降解活性最強，1 μM和5 μM化合物在VCaP細胞中可誘導AR-FL分別降低22.6%和49.3%，AR-V7分別降低54.4%和75.7%。

表1. 柔性Linker的VHL配體的降解活性研究(圖片來源：J. Med. Chem.)

表2. 柔性與半剛性Linker的CRBN配體的降解活性研究(圖片來源：J. Med. Chem.)

剛性Linker的構象限制有助于PROTACs形成穩定的三元復合物，從而顯著提高降解活性。因此，研究人員利用四元或六元雜環片段設計了具有剛性Linker的化合物25-34（表3）。在LNCaP細胞中，化合物28（BWA-522）在1 μM和5 μM下分別降低了48.7%和72.0%的AR-FL。而在VCaP細胞中，BWA-522對AR-FL和AR-V7的顯示出較強降解活性，在1 μM和5 μM下誘導AR-FL和AR-V7分別降低了52.4、73.1%和77.3、84.6%。

最后，研究人員將化合物25-34中沙利度胺的苯環的連接位置從間位改為鄰位，合成了化合物35-44（表4）。Western blotting結果顯示， LNCaP細胞中，這些化合物誘導AR-FL蛋白水降解效果大多優于相應的間位取代化合物。活性最高化合物39在LNCaP細胞中分別誘導降低了13.9%（1 μM）和62.4%（5 μM）的AR-FL。在VCaP細胞中，給藥濃度1 μM和5 μM時，39誘導AR-FL分別降低44.3%和57.2%，誘導AR-V7分別降低37.1和72.7%。

表3. 剛性Linker的CRBN配體的降解活性研究(圖片來源：J. Med. Chem.)

表4. 不同取代位置剛性Linker的CRBN配體的降解活性研究(圖片來源：J. Med. Chem.)

研究人員選擇初篩活性較好的的化合物24、BWA-522與39在小鼠中進行PK測試（表5）。經2 mg/kg靜脈給藥后，化合物BWA-522的AUC最高為3018 h·ng/mL，且血漿清除率較低為594 mL/h/kg。同時，研究人員還比較了三個化合物口服效率，發現化合物BWA-522具有極好的口服血漿暴露，AUC值為5947 h·ng/ml，優于化合物24與39?；衔顱WA-522的口服生物利用度為40.5%，而化合物24和39的口服生物利用度分別僅為7.8%和12.3%。

表5. 化合物24、BWA-522和39在小鼠體內的PK數據(圖片來源：J. Med. Chem.)

鑒于BWA-522在小鼠中的良好口服利用度，我們進一步評估了其在比格犬中的PK（表6）。當口服劑量為5 mg/kg時，BWA-522的t1/2為31.2 h，口服生物利用度為69.3%。這些結果共同表明BWA-522是一種具備口服活性PROTAC分子。

表6. 化合物BWA-522在比格犬體內的PK數據(來源：J. Med. Chem.)

研究人員選擇BWA-522在LNCaP、VCaP和22Rv1三種前列腺癌細胞系進行詳細的Western blotting檢測。其中22Rv1是一種CRPC細胞系，并對恩雜魯胺耐藥。結果顯示（圖4），BWA-522顯著降低了3種細胞系中AR-FL和AR-V7的水平，并呈現出良好的時間與劑量依賴性。BWA-522誘導LNCaP、VCaP和22Rv1細胞中AR-FL蛋白降解，其DC50分別為3.45、0.73和2.41 μM（圖4D）。它在VCaP和22Rv1細胞中也實現了AR-V7蛋白的高效降解，其DC50分別為0.67和0.76 μM（圖4E）。

圖4 前列腺癌細胞系AR-FL或AR-V7蛋白的Western blotting分析(圖片來源：J. Med. Chem.)

接下來，研究人員研究BWA-522在前列腺癌細胞系中的降解機制。在BWA-522處理前，分別用蛋白酶體抑制劑MG132（3 μM）、活化E1酶抑制劑MLN4924 （1 μM）和CRBN配體沙利度胺（100 μM）預處理細胞。結果顯示BWA-522降解效果明顯減弱（圖5），證明BWA-522對AR-FL和AR-V7的降解依賴細胞中的泛素-蛋白酶體系統。

圖5 BWA-522降解AR-FL及AR-V7的作用機理(圖片來源：J. Med. Chem.)

AR及其變體在調節AR依賴性前列腺癌細胞的增殖中起著至關重要的作用，因此研究人員測試了BWA-522在LNCaP、VCaP和22Rv1細胞中的抗增殖能力。如圖6所示，BWA-522在LNCaP和VCaP細胞中的IC50值分別為1.07和5.59 μM。同時，BWA-522能有效抑制恩雜魯胺耐藥細胞22Rv1的生長，IC50值為4.08 μM。研究人員還在LNCaP和22Rv1細胞系中進行了克隆形成實驗，以評估藥物對細胞增殖的長期抑制作用。與細胞增殖抑制測定結果一致，BWA-522以劑量依賴的方式減少了這兩種細胞系的集落形成（圖7）。

圖6 BWA-522對前列腺癌細胞的抗增殖活性(圖片來源：J. Med. Chem.)

圖7 BWA-522抑制前列腺癌細胞的克隆形成(圖片來源：J. Med. Chem.)

為了研究對AR信號通路的影響，研究人員測試了BWA-522在LNCaP（圖8A）和VCaP（圖8B）細胞中能否抑制AR下游蛋白表達。結果顯示BWA-522能劑量依賴性地抑制兩種細胞系TMPRSS2、FKBP51和PSA蛋白水平。

圖8 BWA-522對AR信號通路的影響(圖片來源：J. Med. Chem.)

研究人員評估了口服BWA-522對LNCaP異種移植腫瘤模型小鼠的抗腫瘤呢能力。結果顯示（圖9），兩種給藥劑量的BWA-522均能有效抑制腫瘤的生長。治療結束時，與對照組相比，口服20和60 mg/kg BWA-522對腫瘤生長的抑制作用分別為26%和76%，表現出優于AR拮抗劑EPI-002（180 mg/kg，PO）的腫瘤抑制活性。此外，研究人員還進行了BWA-522毒理研究，以評估其在ICR小鼠中的潛在副作用。BWA-522以20和60 mg/kg的劑量每日口服給藥，連續14天。在治療結束時，兩劑量組均未觀察到明顯的動物體重減輕或器官損傷，表明BWA-522在體內具有良好的體內耐受性。

最后，研究人員評估了BWA-522體外一些成藥特性。結果顯示，該化合物在人或鼠的肝微粒體與血漿中都保持了較好的穩定性，并無明顯hERG毒性。

圖9 BWA-522對LNCaP異種移植瘤模型小鼠的抗腫瘤活性研究(圖片來源：J. Med. Chem.)

總結

綜上，秦沖教授課題組發現的化合物BWA-522，是一種有效的口服生物可利用的AR-NTD PROTAC降解劑，有望成為治療AR-FL和AR-V7依賴性腫瘤的候選藥物。

該工作特別致謝中國海洋大學和青島海洋科學與技術國家實驗室的支持。中國海洋大學博士研究生張博聞，碩士研究生劉暢、楊振乾和工程師張賽為該論文共同第一作者，秦沖教授為通訊作者。該工作得到國家重點研發計劃、國家自然科學基金及山東省自然科學基金優秀青年基金等項目的資助。

課題組簡介

課題組研究方向為：

（1）基于靶向蛋白降解（PR OTACs）策略的小分子先導化合物發現和新藥發現；

（2）去勢抵抗性前列腺癌治療藥物研究；

（3）海洋天然活性物質的結構多樣性修飾及成藥性優化。

課題組近期成果介紹：

（1）秦沖教授團隊聯合浙江大學藥學院高建青教授團隊設計制備了一種載有雄激素受體PROTAC化學藥物的微針貼片，通過降解毛囊內的雄激素受體來實現毛發再生。

在AGA治療實驗中，與每日使用的陽性對照米諾地爾相比，該微針貼片只需一次給藥即可達到質量相當的毛發再生，且再生速度更快。同時該微針在停藥后仍能維持藥效，在再復發模型上仍能實現高質量的毛發再生，有望克服臨床治療手段停藥后易復發的缺陷。 （Small Methods, 2023, 7(1):e2201293. doi: 10.1002/smtd.202201293. IF=14.188）

（2）秦沖教授團隊評估了新型BET降解劑QCA570在多種膀胱癌細胞中的生物學功能，并探討其潛在機制。

QCA570在納摩爾濃度下可誘導BRD4蛋白降解，其DC50約為1 nM。QCA570可以通過轉錄抑制和誘導靶蛋白降解進而降低EZH2和c-MYC表達水平。此外，QCA570顯著誘導細胞凋亡和周期阻滯，對膀胱癌細胞具有潛在療效。 （Front Chem, 2023, 11:1 121724. doi: 10.3389/fchem.2023.1121724. IF=5.545）

（3）秦沖教授團隊報道了一類新型AR拮抗劑-Hsp90抑制劑偶聯分子的最新研究進展，該分子不僅可以提升藥物的腫瘤靶向，減少不必要的毒副作用，還可以通過AR和Hsp90的雙靶點協同抑制，達到提升藥效和克服CRPC耐藥的目的。（J. Med. Chem. 2023, 66, 7, 4784–4801. DOI: 10.1021/acs.jmedchem.2c01970. IF=7.3）

導師介紹

秦沖博士 ，中國海洋大學教授、博士生導師，青島海洋生物醫藥研究院副院長。2010年畢業于中國農業大學應用化學專業，獲學士學位；2015年畢業于北京大學藥物化學專業，獲博士學位（導師：焦寧教授）；2016-2019年在美國密歇根大學從事博士后研究（導師：王少萌教授）；2019年回國后在中國海洋大學獨立開展研究工作，主持國家高層次青年人才項目（2021）、國家重點研發計劃青年科學家項目（2022）、國家自然基金青年基金（2021）、山東省“泰山學者”青年專家（2020）、山東省自然基金優秀青年基金（2021）等研究項目，獲北京市自然科學獎一等獎（2019）。

近年來在 J. Am. Chem. Soc.、Angew. Chem. Int. Ed.、Small. Methods.、 J. Med. Chem. 等雜志發表學術論文20余篇，申請國際發明專利十余項。

聯系方式：qc@ouc.edu.cn。

文獻詳情：

Bowen Zhang, Chang Liu, Zhenqian Yang, Sai Zhang, Xiaolin Hu, Baohu Li, Mei Mao, Xiao Wang, Zhuoyue Li, Shumin Ma, Siqi Zhang, and Chong Qin*. Discovery of BWA-522, a First-in-Class and Orally Bioavailable PROTAC Degrader of the Androgen Receptor Targeting N-Terminal Domain for the Treatment of Prostate Cancer. J. Med. Chem.2023,https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.3c00585