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納米孔道蛋白質單分子測序技術的關鍵問題之一是如何提高現有納米孔道傳感界面的空間分辨能力。近日，南京大學龍億濤教授團隊與北京大學陳鵬教授團隊通過長期的共同合作與探索，將基于吡咯賴氨酸的遺傳密碼子擴展技術應用于Aerolysin納米孔道界面。經過4年的摸索及體系優化，實現將非天然氨基酸高效地引入了納米孔道的傳感區域內，從而設計調控了孔道識別靈敏域內每一個氨基酸殘基的空間取向，獲得了三維化學及物理環境可控的蛋白質孔道界面，有效提高了納米孔道對單個多肽分子的空間分辨能力（圖1）。

圖1. 非天然氨基酸構建的納米孔道靈敏域用于多肽單分子分析。

雙方團隊通過篩選高效的氨酰tRNA合成酶和優化Aerolysin蛋白的表達條件，將非天然氨基酸插入的成孔蛋白產量提高至5 mg/L（圖2）。大量重復實驗表明，該成孔蛋白的開孔電流標準差與野生型孔道蛋白相當，證明了遺傳密碼子擴展技術的高產物均一性。

圖2.非天然氨基酸編碼的Aerolysin成孔蛋白高表達體系。

進一步，通過分子動力學模擬和納米孔道單分子電化學實驗研究了非天然氨基酸構建的傳感區域。相較于天然疏水氨基酸殘基在Aerolysin孔道內的貼壁行為，較長的芳香族非天然氨基酸側鏈在孔道內呈現有利于多肽檢測的立體幾何構象，形成一個針對多肽上芳香族氨基酸識別的傳感靈敏域。該非天然氨基酸構建的納米孔道將單個多肽分子在孔道內的阻斷時間延長了十倍，實現了對混合樣品中不同長度多肽分子的精準區分（圖3）。

圖3.非天然氨基酸構建納米孔道的全原子模型以及多肽單分子分析。

該方法突破了傳統生物納米孔道修飾方法的局限，建立了非天然氨基酸編碼的成孔蛋白高表達體系，為用于多肽測序的超靈敏納米孔道的理性設計開辟了新道路。

相關成果以“Controlled Genetic Encoding of Unnatural Amino Acid in Protein Nanopore.”為題，發表于德國應用化學（Angewandte Chemie International Edition）, DOI： 10.1002/anie.202300582, 文章鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/anie.202300582。我院博士后武雪原博士為論文第一作者,應佚倫教授和北京大學陳鵬教授為論文的共同通訊作者，該工作得到了科技部國家重點研發計劃（2022YFA1304604）、國家自然科學基金（22027806和22090050）及中國博士后科學基金（2021M691509）的資助。