欧美色盟,色婷婷AV一区二区三区之红樱桃,亚洲精品无码一区二区三区网雨,中国精品视频一区二区三区

2月9日，北京大學(xué)未來技術(shù)學(xué)院、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心陳知行研究員課題組與清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、北京市結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心和北京生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心陳春來課題組在 J. Am. Chem. Soc. 雜志上聯(lián)合發(fā)表題為“General strategy to improve the photon budget of thiol-conjugated cyanine dyes”的文章。該研究報道了一種可替代傳統(tǒng)馬來酰亞胺標(biāo)記化學(xué)的全新靶向巰基的位點特異性標(biāo)記策略，通過S-芳基化類型的生物偶聯(lián)化學(xué)可顯著提高花青類熒光團光穩(wěn)定性，助力單分子和細(xì)胞內(nèi)熒光顯微成像技術(shù)。

近20年來，基于熒光顯微鏡和熒光染料技術(shù)的迅速發(fā)展，科學(xué)家們能夠以前所未有的時空分辨率來觀測生物分子的位置、動態(tài)與功能。大多數(shù)熒光成像技術(shù)，如單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移（smFRET）、單分子追蹤、單分子定位顯微鏡（SMLM）、受激輻射損耗（STED）顯微鏡和MINFLUX顯微鏡，對于染料的一個核心訴求，便是讓每個熒光團分子在光漂白前發(fā)射出更多的光子，即提高熒光染料的光穩(wěn)定性，以實現(xiàn)長時程、高時空分辨率的成像。

在熒光顯微成像時，往往需要將染料精確特異地標(biāo)記在目標(biāo)生物分子，甚至特定的標(biāo)記位點上。迄今為止，與氨基反應(yīng)的琥珀酰亞胺（NHS）酯和與巰基反應(yīng)的馬來酰亞胺（MAL）是兩個最常用且廣泛商業(yè)化的標(biāo)記模塊，用于將有機熒光團共價連接到目標(biāo)生物分子上。通常，NHS-氨基的化學(xué)被用于位點特異性地標(biāo)記核酸和非特異性地標(biāo)記蛋白質(zhì)，這是因為含有氨基的賴氨酸殘基在蛋白質(zhì)中豐度較高。而含有巰基的半胱氨酸在蛋白質(zhì)中的豐度較低，因而可以通過蛋白定點突變移除內(nèi)源性的半胱氨酸并在標(biāo)記位點引入半胱氨酸，利用MAL-巰基標(biāo)記化學(xué)實現(xiàn)蛋白質(zhì)上的位點特異性標(biāo)記，這一標(biāo)記方法在單分子熒光和單分子FRET技術(shù)中的應(yīng)用尤為廣泛和重要。

圖1 單分子熒光技術(shù)測試示意圖與MAL造成的染料光穩(wěn)定性下降

單分子熒光領(lǐng)域的研究者們發(fā)現(xiàn)，通過MAL-巰基標(biāo)記在蛋白上的熒光團的光漂白速度要比相同的標(biāo)記在DNA上的熒光團顯著加快。長期以來，人們將這一現(xiàn)象歸于蛋白質(zhì)上復(fù)雜的微環(huán)境加速了熒光團的光漂白。8年前（2015年），陳春來課題組在實驗中意外發(fā)現(xiàn)，即便是標(biāo)記在相同序列DNA鏈上的相同熒光團分子，僅是NHS-氨基和MAL-巰基標(biāo)記化學(xué)的差異，就會顯著影響熒光團的光學(xué)特性和光漂白（圖1）。進(jìn)一步的測試發(fā)現(xiàn)，這一現(xiàn)象廣泛存在于各類染料之中，無論母體是羅丹明類（Rhodamine）還是花青（Cyanine）類染料，都會因MAL標(biāo)記方式而造成約2—5倍不等的光穩(wěn)定性下降（圖1）。基于結(jié)果猜測，MAL標(biāo)記形成的高活性的硫醚基團加速了染料的光漂白。

圖2 不同標(biāo)記策略化學(xué)反應(yīng)示意圖

在發(fā)現(xiàn)了新現(xiàn)象和揭示了新機制后，下一步自然是提高巰基標(biāo)記化學(xué)的光穩(wěn)定性。2018年，陳知行加入北京大學(xué)，建立了分子探針技術(shù)實驗室，兩個不同背景的課題組在此碰撞出了火花。他們嘗試?yán)每臻g位阻效應(yīng)，調(diào)節(jié)連接基團的長度和結(jié)構(gòu)，阻礙硫醚基團與熒光團的碰撞，從而減弱光漂白，提高光穩(wěn)定性。然而這一策略并不順利。2020年夏天，陳知行課題組提出通過改變硫醚的電子性質(zhì)的策略來影響光漂白，并將目光投向了生物偶聯(lián)化學(xué)。目前廣泛應(yīng)用的NHS和MAL化學(xué)已經(jīng)是20世紀(jì)五六十年代的成果了，近年來雖然也有一系列可以替代MAL的生物偶聯(lián)模塊發(fā)表，但是由于MAL化學(xué)的反應(yīng)速度和反應(yīng)效率已經(jīng)足夠滿足一般實驗的需求，新一代的生物偶聯(lián)化學(xué)完全沒有落到實際應(yīng)用層面。但幸運的是，近10年來發(fā)展了一系列基于S_NAr反應(yīng)的生物偶聯(lián)模塊，它們與巰基反應(yīng)后的產(chǎn)物都是與缺電子的芳基共軛的硫醚（圖2）。于是，苯基氧化二唑（POD）、對氯硝基苯（PCB）和五氟苯探針（FBP）為偶聯(lián)模塊的花青染料被合成出來并進(jìn)行了測試。測試結(jié)果中表現(xiàn)最好的POD模塊相比MAL模塊而言，對于兩種花青染料Cy3和Cy5在DNA上分別有2.3倍與2.5倍的改善，在不同蛋白質(zhì)的不同標(biāo)記位點上也分別有1.4—2.6倍和1.3—3.1倍的改善。后續(xù)，這一策略被擴展到Cy3B和Cy5B兩種光學(xué)性質(zhì)更優(yōu)的染料上，并對這些染料對進(jìn)行了單分子FRET持續(xù)時間的測試和比較。結(jié)果為應(yīng)用POD的模塊對可以相對MAL模塊大幅改善染料光穩(wěn)定性（圖3），為單分子熒光技術(shù)提供了更好的工具。

圖3 POD策略延長了smFRET技術(shù)的測量時長

綜上，這項研究發(fā)現(xiàn)了影響染料光穩(wěn)定性的新的關(guān)鍵因素，并且在此基礎(chǔ)上提出了全新的策略用于改善基于巰基的共價標(biāo)記熒光團的光穩(wěn)定性。值得指出的一點是，該策略為生物偶聯(lián)反應(yīng)的開發(fā)領(lǐng)域提供了一種全新的視角。從前對生物偶聯(lián)策略的評價往往都是對于底物反應(yīng)性、反應(yīng)效率和產(chǎn)物穩(wěn)定性等關(guān)于反應(yīng)本身的種種考量；從此研究中可以看到，反應(yīng)生成的產(chǎn)物基團可能會直接影響后續(xù)的應(yīng)用結(jié)果，為科學(xué)工作者應(yīng)用生物偶聯(lián)反應(yīng)提供了新的考量角度。該研究對于染料的改進(jìn)方式簡潔，可以由商業(yè)可得的花青類染料直接改造得到，無需從頭設(shè)計與合成染料分子，具有較好的應(yīng)用前景。

北京大學(xué)未來技術(shù)學(xué)院2019級博士生張源、清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士后楊辰為本文的共同第一作者。陳春來、陳知行為本文的共同通訊作者。清華大學(xué)已畢業(yè)博士生彭思佳和張璐嘉進(jìn)行了重要的探索工作。國家自然科學(xué)基金委、科技部國家重點研發(fā)計劃、北京市生命科學(xué)前沿培育項目、北京市結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心和北京生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心提供了經(jīng)費資助。清華大學(xué)蛋白質(zhì)研究技術(shù)中心細(xì)胞影像平臺提供了技術(shù)支持。

陳春來課題組長期關(guān)注單分子熒光技術(shù)的開發(fā)并揭示生物分子的動態(tài)和機制。陳知行課題組一直致力于通過化學(xué)原理設(shè)計并研發(fā)新型探針，助力未來成像技術(shù)的發(fā)展。兩個團隊均常年招收博士研究生和博士后，歡迎關(guān)心未來熒光技術(shù)發(fā)展的同學(xué)和同事加入。