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（封面圖片）

手性α-三級胺是許多藥物和天然產(chǎn)物分子的重要結(jié)構(gòu)片段，現(xiàn)已發(fā)展了諸多構(gòu)建手性α-三級胺的催化方法。此外，手性α-三級胺也可由相應三級硝基化合物直接還原得到，但三級硝基化合物的催化不對稱合成方法尚且有限，通常由過渡金屬催化的烯丙基化或有機小分子催化的加成反應得到，亟待發(fā)展更多的催化方法。對二級硝基化合物進行C-烷基化反應是一類潛在的直接構(gòu)建三級硝基化合物的方法，但是這類反應通常伴隨著較多的硝基O-烷基化反應副反應。為解決這個難題，前人采用單電子轉(zhuǎn)移機理以及特殊的親電試劑來提高C-烷基化的化學選擇性。例如，Watson課題組以烷基鹵代物為親電試劑，發(fā)展了一系列過渡金屬催化的硝基化合物C-烷基化反應，隨后實現(xiàn)了該類反應的不對稱催化。然而，通過對硝基化合物不對稱C-烷基化來得到手性三級硝基化合物的催化方法還未見報道。

生物催化以高效、高選擇性、易進化著稱，美國康奈爾大學的Todd Hyster教授課題組的研究者嘗試采用生物催化的方法來實現(xiàn)對硝基化合物的不對稱C-烷基化反應。盡管已有許多酶催化的共軛加成或亨利反應可以利用nitronate（去質(zhì)子化的硝基烷烴）作為親核試劑，但沒有一例可以制備手性三級硝基化合物。由于天然酶并不能催化硝基化合物C-烷基化反應，他們發(fā)展了一種全新的非天然光酶催化策略，以α-鹵代羰基化合物1作為烷基化試劑，在可見光激發(fā)的烯酮還原酶（‘ene’-reductases, EREDs）催化下，高化學選擇性和對映選擇性地實現(xiàn)了對硝基烷烴的C-烷基化反應，得到了高價值的手性三級硝基化合物3（圖1B）。

值得注意的是，該團隊近期采用類似的非天然光酶催化策略，以α-鹵代羰基化合物和α-芳香取代硝基烷烴為親電試劑，實現(xiàn)了高交叉和對映選擇性的Csp³–Csp³親電偶聯(lián)反應（XEC）,見化學加報道《Nature：不對稱sp3-sp3交叉親電偶聯(lián)——“酶”有可能嗎？》（Nature 2022, 610, 302–307）。該光酶催化XEC的關鍵步驟包括光誘導的選擇性自由基引發(fā)、自由基加成、硝基自由基中間體發(fā)生C–N鍵均裂（硝基離去）、選擇性氫原子轉(zhuǎn)移淬滅。作者設想，如果可以通過酶來控制自由基加成的立體選擇性，同時減慢硝基自由基6的C–N鍵均裂，加速該自由基中間體的氧化，便可得到手性三級硝基化合物3（圖1B）。

首先，作者以α-氯代酰胺1a和α-芐基硝基乙烷2a為模板底物，在青藍光（Cyan light, λ_max = 497 nm）激發(fā)下，篩選了一系列烯酮還原酶，發(fā)現(xiàn)大多酶都可以催化反應得到消旋的三級硝基化合物3a。其中，只有來自Geobacillus kaustophilus菌株的烯酮還原酶（GkOYE）能夠以56%的產(chǎn)率和78:22的er值得到(R)-型目標產(chǎn)物3a。有意思的是，當使用先前可高效催化1a和α-苯基硝基乙烷進行XEC的烯酮還原酶CsER時，也可以得到目標產(chǎn)物3a（85%, 50:50 er）。作者認為該化學選擇性（C-烷基化vs XEC）來源于烷基取代的硝基自由基6的C–N鍵均裂速度較慢，從而傾向于發(fā)生單電子氧化，凈反應為氧化還原中性。對照實驗證實，烯酮還原酶和Cyan光對于反應性至關重要（圖1C）。隨后，作者基于GkOYE蛋白結(jié)構(gòu)，采用迭代飽和突變策略對GkOYE進行了三輪定向進化，最終找到一個三突變體D73C/A104H/Y264W（GkOYE-G7，0.5 mol%）可高效、高立體選擇性地催化反應得到3a（96%, 96:4 er, 圖1D），且該反應可以放大到1.0 mmol規(guī)模（78%, 96:4 er, 196 mg）。

圖 1.光酶催化的硝基化合物不對稱C-烷基化反應。圖片來源：JACS

隨后，作者對該光酶催化體系的底物范圍進行了探索（圖 2）。多種類型的α-芐基取代硝基烷烴2a-z都可以很好地與α-氯代酰胺1a發(fā)生C-烷基化反應。如苯環(huán)的鄰、間、對位可兼容帶有不同電性的取代基，以56–98%的產(chǎn)率以及優(yōu)異的對映選擇性（>93:7 er）得到β-手性四取代硝基酰胺產(chǎn)物（7-16）。但該體系對硝基烷烴α-位取代基的體積比較敏感。此外，該體系還可以兼容不同雜環(huán)，包括富電子的噻吩和缺電子的吡啶、吡嗪取代的硝基烷烴，以91–98%的產(chǎn)率和高對映選擇性（最高95:5 er）得到相應的雜環(huán)取代手性三級硝基化合物（20-26）。同時，直鏈或環(huán)狀脂肪硝基烷烴也可以被該體系接受，得到相應四取代硝基產(chǎn)物（27-37, 22–96%），突顯出該光酶催化體系廣泛的底物譜。另外，多種不同類型的α-鹵代羰基化合物均可被該體系兼容，包括α-氯代酰胺（如Weinreb酰胺、環(huán)狀酰胺），α-鹵代酮和α-鹵代酯/砜（需使用CsER）均可與硝基烷烴反應得到相應三級硝基產(chǎn)物（32-37，圖 2）。

圖 2. 底物范圍。圖片來源：JACS

對于高度進化的酶，它們通常具有很高的反應專一性。作者發(fā)現(xiàn)，當采用CsER來催化1a與α-芳香取代硝基烷烴38的反應時，主要得到XEC產(chǎn)物39b-43b（82–93%, 最高99:1 er），以及僅微量的C-烷基化產(chǎn)物39a-43a（b/a > 27:1，圖3）。引人注目的是，當采用進化的GkOYE-G7在完全一致的條件下來催化該反應時，卻得到了相反化學選擇性的產(chǎn)物，即主要得到C-烷基化產(chǎn)物39a-43a（65–92%, 最高99:1 er），而幾乎觀察不到XEC產(chǎn)物39b-43b（a/b > 25:1, 圖3）。到此，作者發(fā)展了兩個高度專一的酶催化劑，GkOYE-G7可高效催化硝基化合物的C-烷基化，而CsER則可更好的催化XEC反應，即硝基的“留”或“去”取決于酶，充分體現(xiàn)了生物催化優(yōu)越的化學選擇性。

圖 3. 酶控制反應性。圖片來源：JACS

隨后，作者設計了一條巧妙“單酶雙機理”的串聯(lián)反應，即原料硝基烯烴44先經(jīng)由烯酮還原酶的天然氫負轉(zhuǎn)移機理被還原成硝基烷烴，隨后硝基烷烴再通過非天然自由基機理發(fā)生C-烷基化反應，“一酶兩步”生成三級硝基化合物。以GkOYE-G7為催化劑，該串聯(lián)反應具有很廣的底物譜，原料硝基烯烴44全部轉(zhuǎn)化為相應硝基烷烴，且以較高的產(chǎn)率和立體選擇性得到三級硝基終產(chǎn)物（86–96%, 最高96:4 er, 圖4A）。最后，作者對三級硝基酶產(chǎn)物3a進行還原，得到相應手性α-三級胺45（65%，96:4 er, 圖4B）。

機理方面，作者通過UV-Vis光譜實驗證實FMN_hq、α-氯代酰胺1a、硝酮（nitronate模擬物）在酶的活性口袋內(nèi)形成了四元電荷轉(zhuǎn)移復合物（CT complex）。激發(fā)該四元復合物可實現(xiàn)FMN_hq對1a選擇性的單電子還原，得到α-酰胺自由基4，該自由基隨后對nitronate 5進行立體選擇性加成得到硝基陰離子自由基6，最后被FMN_sq單電子氧化得到產(chǎn)物3（圖1B）。

圖 4. 串聯(lián)反應及產(chǎn)物衍生化。圖片來源：JACS

總之，本文采用非天然光酶催化策略，實現(xiàn)了對消旋二級硝基烷烴的不對稱C-烷基化反應，獲得了過渡金屬催化難以得到的手性三級硝基產(chǎn)物，進一步拓展了酶催化反應類型的邊界，對現(xiàn)有化學方法起到很好的互補。基于酶本身所特有的高選擇性和易進化性，結(jié)合化學原理和蛋白改造，是未來實現(xiàn)更多非天然、普適生物催化方法的有效策略。相關成果在JACS上發(fā)表，康奈爾大學博士后付海根和二年級博士生喬天章為本文的共同一作，Todd Hyster教授為通訊作者。

招聘信息：付海根博士將于2023年2月加入中國醫(yī)學科學院/北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)藥生物技術研究所開展研究工作，目前以第一或共同一作在Nature, Nature Catalysis, JACS, J Med Chem等高水平期刊上發(fā)表論文十余篇，入選2022年國家海外青年人才計劃。課題組的主要研究方向為生物催化及藥物化學，將致力于發(fā)展新的生物催化方法學用于藥物的研發(fā)和制備，具體包括：1. 新酶發(fā)現(xiàn)或探索酶的非天然機理，解鎖酶催化的全新反應類型；2. 采用酶-化學偶聯(lián)來制備手性藥物中間體；3. 抗耐藥菌、病毒小分子藥物研發(fā)。因工作需要，擬公開招聘具有藥物化學、有機化學、生物催化、化學生物學等背景的助理研究員2名（國家正式事業(yè)編制，需海外博后經(jīng)歷或國內(nèi)博后出站）和博士后1名，同時還有少量博士和碩士生名額，歡迎申請或推薦，請將申請材料（簡歷、研究總結(jié)、代表作等，申請材料將嚴格保密）發(fā)送至人事處辛老師郵箱imb_hrm@126.com，同時抄送付老師fuhaigen@hotmail.com。