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在可見光區進行光轉化的熒光染料在生物成像領域中發揮著重要作用。雖然高效的光轉換熒光蛋白已經得到應用，但是如何發展小尺寸、高性能和實用性強的光轉換熒光探針仍是值得關注的問題。利用雙色光轉化熒光團（DCPFs）在轉化前后發光顏色及強度的變化，研究者可以用來追蹤標記物的動態變化。目前，DCPFs的設計原則包括羅丹明染料的脫烷基化、花菁類染料的光截斷、AIE分子的光脫氫環化、噁嗪的螺吡化和光氧化脫氫等。盡管DCPFs的發展已經取得了很大的進步，但是仍存在著光轉換效率低、發光強度弱以及需要光毒性的紫外光激發等缺陷。

本文中，作者建立了構筑DCPFs的新策略，即基于定向光氧化誘導轉換（DPIC）機理。作者認為熒光團在經歷部分定向光漂白后，激發和發射光譜會發射移動。

熒光團在光照后產生單線態氧發生光漂白，導致不可逆的光化學裂解生成不發光產物。作者設想在熒光團上修飾芳香性單線態氧活性基團（ASORM）后可以1）增加體系的共軛導致光譜紅移；2）單線態氧定向氧化ASORM后，導致共軛結構被破壞，從而引起激發和發射光譜的移動（Figure 1）。

Figure 1. 定向光氧化誘導轉化（DPIC）原理及光照后分子的化學結構（圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.）

研究中，作者選擇香豆素作為小尺寸、高亮度藍光發射的熒光團。香豆素染料具有高摩爾消光系數、明亮發射和低細胞毒性的特點，非常適合作為熒光成像探針。小尺寸的吡咯和呋喃基團能夠在單線態氧作用下發生光氧化導致脫芳構化，因此被選作為ASORM。香豆素骨架與N-甲基吡咯和呋喃通過Witing反應偶聯分別得到共軛程度提高的苯乙烯基-香豆素類衍生物SC-P和SC-F（Figure 1）。為了證明在光轉換過程中ASORM的獨特作用，作者還合成了苯乙烯基-香豆素噻吩（SC-T）和苯乙烯基-香豆素茴香醚（SC-A）作為對照。

Figure 2. SCs的光譜研究和光照實驗（圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.）

作者對合成的苯乙烯基-香豆素類衍生物（SCs）進行了光學性質表征。SCs在不同溶劑中都表現為高亮度發射和大摩爾消光系數，并伴隨著輕微的溶劑化效應。在甲醇溶劑中，SC-T、SC-F和SC-A的吸收和發射峰位置相近，分別在425和512 nm處（Figure 2A），熒光量子產率能夠達到0.77，SC-P表現出明顯的光譜紅移現象。為了表征化合物的雙色光轉換特性，作者用488 nm激光激發染料的甲醇溶液并記錄下不同時間點下的發射光譜（Figure 2B）。實驗結果表明，與SC-A和SC-T表現的緩慢光漂白現象相比，含有ASORM的SC-F和SC-P則表現出在光照后明顯的藍移現象，分別移動了24 nm和68 nm，發射波長也分別藍移至486 nm和483 nm（Figure 2C-D）。為了更好地表征光轉換產物（cSC），作者對光照前后的化合物進行了液質色譜分析（Figure 2E）。數據顯示SC-P和SC-F會轉換為氧化形式的異構體，由于ASORMs的脫芳構化會使其吸收光譜出現藍移。同時，由于光轉換產物cSC-P 、cSC-F和SC-V的激發和發射光譜的相似性，可以推斷出光轉換的機制來源于香豆素和ASROM之間共軛程度的破壞（Figure 2F）。

Figure 3. 定向光氧化誘導轉化的內在機制（圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.）

如Figure 3所示，SC-P在被可見光照射后達到激發態，再傳能至三線態氧³O₂，³O₂通過系間穿越過程和三線態弛豫過程產生單線態氧¹O₂）。在單線態氧的存在下，SC-P經歷了光轉換過程。以上實驗證明了DPIC機制導致了熒光探針的雙發射光轉換性質。

Figure 4. SC-P標記的Hela細胞的共聚焦成像圖片（圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.）

為了證明基于DPIC機制的熒光探針的實用性，作者將具有最快光轉換速率和波長變化最大的化合物SC-P作為研究對象，并將其對Hela細胞進行染色標記（Figure 4）。從Fgiure 4A-B中可以看出，在488 nm激發光照射下，光轉化過程發生并伴隨著SC-P強度的減弱和cSC-P強度的增加。同時，作者將SC-P與商用染料SMCy 5.5進行共染，可以看出SC-P的親脂性和電中性使其可以特異性地靶向脂滴，共定位系數能夠達到83%（Figure 4C）。此外，光轉換后的產物cSC-P也依然能夠保持對脂滴良好的靶向性（Figure 4D）。最后，作者又證明了SC-P和cSC-P能夠對脂滴進行時空動態示蹤，可以媲美于商用染料SMCy 5.5的成像效果（Figure 4E-F）。