多取代的6元環骨架是藥物分子和活性天然產物中常見的結構單元。近年來，對于手性環己烷的合成研究受到學術界和制藥工業界的廣泛關注。狄爾斯-阿爾德反應（Diels-Alder reaction，簡稱D-A反應）即共軛雙烯（二烯體）與取代烯烴（親二烯體）之間發生的[4+2]環加成反應，是合成化學中構建六元環骨架最常用的方法之一，已經在天然產物全合成中得到了廣泛運用。但傳統的不對稱D-A反應在立體選擇性以及反應模塊性方面存在明顯的不足，這極大的限制了其在藥物合成上的應用。鑒于酶催化往往具有高效、綠色的特點，近年來對于D-A反應酶的挖掘和工程化改造受到廣泛關注。北京大學化學與分子工程學院雷曉光課題組在此前的工作中，從桑樹中發現了首例催化分子間endo 或exo選擇性D-A反應的酶（MaDAs），并對其催化機理，底物范圍進行了深入研究，為進一步對該家族的酶工程改造奠定了基礎（Gao et al, Nat. Chem., 2020, 12, 620；Gao et al, Nat. Catal., 2021, 4, 1059）。2022年11月16日，雷曉光課題組在在Cell Press細胞出版社期刊Chem Catalysis 上報道了針對D-A酶MaDA1的蛋白工程改造，并通過將酶催化的D-A反應與金屬催化脫羧官能團化反應巧妙結合，利用生物催化與化學催化相輔相成和優勢互補的特點，實現了環己烯骨架的多樣性導向、精準合成。該研究工作為結構多樣的六元環骨架的合成提供了新的思路，拓展了酶催化的應用范圍。本研究巧妙地設計了親雙烯體1a，在與天然底物具有一定相似性的同時引入供后期脫羧官能團化的羧基前體酯基，以實現酶催化的D-A反應之后對產物進一步的多樣性衍生。經過酶催化活性篩選，作者發現D-A酶MaDA1能夠實現所設計的D-A反應，但反應收率、選擇性需要進一步優化（43%， 93 ee%， 192 TTN， endo/exo = 4/1），對于MADA1的工程化改造勢在必行。作者采用聚焦理性迭代位點特異性突變的策略（focused rational iterative site-specific，mutagenesis, FRISM），以極小的突變成本便獲得了最佳突變體。首先利用丙氨酸篩選，對MaDA1口袋29個位點進行突變，確定了五個突變熱點。考慮到丙氨酸（A）、纈氨酸（V）、絲氨酸（S）、苯丙氨酸（F）等四種氨基酸在具有不同大小的同時，能夠誘導底物與酶形成不同的相互作用，故以這四種氨基酸對選定熱點進行突變。經過了三輪的突變和反應條件的優化，最佳突變體MaDA1-M3的催化效率提高了34倍，ee 值提高到>99%，產率提高到93%，TTN提高了14倍（如圖1）。
為了進一步拓展最佳突變體MaDA1-M3的應用范圍，作者系統探索了MaDa1-M3的底物范圍，其對多種親雙烯體和雙烯體的D-A反應展現出優異的活性和立體選擇性，實現了一系列環己烯骨架的高效精準合成，如圖2所示。
進一步通過將D-A產物進行全局性的酚羥基保護、芐基脫除、羧基活化，得到了脫羧官能團化的前體。該前體可用于多種不同的金屬催化脫羧官能團化反應（如脫羧烯基化、脫羧炔基化、脫羧芳基化、脫羧烷基化、脫羧氫化、脫羧Giese反應、Curtius重排等），從而進一步轉化為結構多樣的環己烯骨架（如圖3）。通過將生物催化的高立體選擇性與過渡金屬催化的適應底物多樣性有機結合，快速、高效構建結構多樣的化合物庫，為環己烯類型化合物的藥物篩選和開發奠定了基礎。
圖3. 酶催化D-A反應串聯金屬催化脫羧官能化反應綜上所述，雷曉光課題組首次利用丙氨酸篩選與聚焦理性迭代位點特異性突變（FRISM）相結合的方式，實現了對D-A酶的蛋白工程改造，提升了酶催化活性和底物適用性。通過將酶催化的分子間D-A反應與多種過渡金屬催化的脫羧官能團化反應相結合，成功實現了結構多樣的手性環己烷骨架的構建。該工作為多取代手性環己烷骨架的高效合成提供了新的方法。在該研究中，雷曉光課題組北京大學“博雅博士后”王進博士為第一作者，雷曉光教授以及雷曉光課題組特聘副研究員高磊博士為共同通訊作者。雷曉光課題組的博士研究生楊軍、郭念昕和丁琪在蛋白表達方面提供了幫助；博士研究生柯瀚、湯汝堯和本科生胡康德龍在底物合成和消旋體產物合成上提供了幫助。該工作得到國家自然科學基金，國家科技部重點研究發展計劃，北京市“卓越青年科學家計劃”，北京分子科學國家研究中心，北大-清華生命科學聯合中心等多個國家重大科研項目和研究機構的資助。雷曉光課題組所開展的化學酶法合成研究工作也得到了瑞士諾華制藥公司的資助。Diversity-oriented synthesis of cyclohexenes by combining enzymatic intermolecular Diels-Alder reactions and decarboxylative functionalizationsJin Wang, Han Ke, Jun Yang, Nianxin Guo, Kangdelong Hu, Ruyao Tang, Qi Ding, Lei Gao, Xiaoguang LeiChem Catal., 2022, DOI: 10.1016/j.checat.2022.10.027
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