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生物體內(nèi)的C-H鍵羥化反應(yīng)，普遍通過(guò)含鐵加氧酶來(lái)實(shí)現(xiàn)。在羥化反應(yīng)中，加氧酶將氧分子轉(zhuǎn)化為具有底物羥化能力的含氧活性中間體實(shí)現(xiàn)O₂的活化。對(duì)于雙鐵羥化酶，目前經(jīng)典的O₂活化機(jī)制源于可溶性甲烷單加氧酶（sMMO），其特點(diǎn)是O₂活化后形成菱形雙四價(jià)Fe₂^IVO₂中間體（Q），接著通過(guò)Q抓氫過(guò)程，羥化甲烷中惰性C(sp³)-H鍵（圖1），該O₂活化機(jī)制常被用于推測(cè)其它雙鐵羥化酶的反應(yīng)機(jī)制。然而，最近實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于甲苯單加氧酶（T4MO）中苯環(huán)C(sp²)-H的羥化過(guò)程，其機(jī)制并非通過(guò)形成Q，而是在O-O鍵未斷裂之前，O₂活化形成的超氧物種進(jìn)攻苯環(huán)（圖1）。因此，探究C(sp³)-H鍵羥化過(guò)程是否還存在其它O₂活化機(jī)制，是雙鐵加氧酶研究領(lǐng)域中一個(gè)重要的科學(xué)問(wèn)題。 

圖1 雙鐵羥化酶的O₂活化和C-H鍵羥化機(jī)制 

在國(guó)家自然科學(xué)基金委、科技部、中科院的支持下，化學(xué)所光化學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室陳輝研究員團(tuán)隊(duì)在理論計(jì)算研究雙鐵加氧酶O₂活化機(jī)理方面取得系列突破。在前期工作中（J. Am. Chem. Soc. 2017, 139, 13038-13046），他們利用自創(chuàng)的⁵⁷Fe穆斯堡爾譜多尺度QM/MM模擬方法，成功確定了氯霉素生物合成中重要的雙鐵芳胺加氧酶CmlI的O₂活化中間體結(jié)構(gòu)（圖2，左）。在后續(xù)黃素雙鐵蛋白Tm FDP活化還原NO的反應(yīng)中（Angew. Chem. Int. Ed. 2019, 58, 3795-3799），他們用類似的多尺度模擬策略，首次揭示了黃素雙鐵蛋白中關(guān)鍵的雙亞硝基中間體的第二配位層效應(yīng)，及其對(duì)NO還原的重要影響（圖2，右），從而將多尺度模擬方法的適用范圍從確定O₂活化過(guò)程第一配位層結(jié)構(gòu)，成功拓展到探究NO活化過(guò)程第二配位層結(jié)構(gòu)，為該類多尺度理論計(jì)算模擬方法在雙核鐵酶體系中更廣泛的應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。 

圖2 通過(guò)理論計(jì)算預(yù)測(cè)得到雙鐵芳胺加氧酶CmlI中O₂活化中間體結(jié)構(gòu)（左），以及黃素雙鐵蛋白Tm FDP中NO活化中間體結(jié)構(gòu)與反應(yīng)機(jī)制（右） 

最近，針對(duì)氯霉素生物合成中的第一步轉(zhuǎn)化，即雙鐵羥化酶CmlA催化對(duì)氨基苯丙氨酸（L-PAPA）底物b位C(sp³)-H鍵羥基化反應(yīng)，利用多尺度QM/MM模擬，陳輝研究員團(tuán)隊(duì)首次揭示了其既不同于sMMO，也不同于T4MO的O₂活化新機(jī)制(圖3)。研究發(fā)現(xiàn)，CmlA底物L(fēng)-PAPA中待羥化的b位C(sp³)-H鍵鄰位上自帶的氨基，通過(guò)N-O成鍵，可以協(xié)助O₂活化中O-O鍵發(fā)生異裂。這種氨基輔助的O₂活化機(jī)制，產(chǎn)生了雙三價(jià)Fe₂^IIIO中間體作為CmlA中真正的C(sp³)-H羥基化活性中間體，與雙鐵C(sp³)-H羥化酶sMMO中菱形雙四價(jià)Fe₂^IVO₂中間體Q存在本質(zhì)的不同。由于CmlA中O₂活化時(shí)O-O鍵必須先發(fā)生斷裂，這在機(jī)制上也與雙鐵C(sp²)-H羥化酶T4MO完全不同。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，O₂活化過(guò)程中形成的N-O鍵，在C(sp³)-H羥化完成后，可以逆向發(fā)生斷裂，從而使底物中的氨基得以再生，最終使氨基達(dá)到無(wú)痕協(xié)助O₂活化的效果。最后，研究中發(fā)現(xiàn)的雙鐵第一配位層橋式羥基在O₂配位后的重組現(xiàn)象，也為今后研究相關(guān)雙鐵加氧酶O₂活化過(guò)程中發(fā)現(xiàn)新結(jié)構(gòu)與機(jī)制提供了可能性。相關(guān)結(jié)果發(fā)表于Angew. Chem. Int. Ed. 2022, 61, e202211843。 

圖3 理論計(jì)算揭示雙鐵羥化酶CmlA中獨(dú)特的底物氨基輔助O₂活化機(jī)制