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生物體內(nèi)的C-H鍵羥化反應(yīng)，普遍通過含鐵加氧酶來實現(xiàn)。在羥化反應(yīng)中，加氧酶將氧分子轉(zhuǎn)化為具有底物羥化能力的含氧活性中間體實現(xiàn)O₂的活化。對于雙鐵羥化酶，目前經(jīng)典的O₂活化機制源于可溶性甲烷單加氧酶（sMMO），其特點是O₂活化后形成菱形雙四價Fe₂^IVO₂中間體（Q），接著通過Q抓氫過程，羥化甲烷中惰性C(sp³)-H鍵（圖1），該O₂活化機制常被用于推測其它雙鐵羥化酶的反應(yīng)機制。然而，最近實驗研究發(fā)現(xiàn)，對于甲苯單加氧酶（T4MO）中苯環(huán)C(sp²)-H的羥化過程，其機制并非通過形成Q，而是在O-O鍵未斷裂之前，O₂活化形成的超氧物種進攻苯環(huán)（圖1）。因此，探究C(sp³)-H鍵羥化過程是否還存在其它O₂活化機制，是雙鐵加氧酶研究領(lǐng)域中一個重要的科學問題。 

圖1 雙鐵羥化酶的O₂活化和C-H鍵羥化機制 

在國家自然科學基金委、科技部、中科院的支持下，化學所光化學院重點實驗室陳輝研究員團隊在理論計算研究雙鐵加氧酶O₂活化機理方面取得系列突破。在前期工作中（J. Am. Chem. Soc. 2017, 139, 13038-13046），他們利用自創(chuàng)的⁵⁷Fe穆斯堡爾譜多尺度QM/MM模擬方法，成功確定了氯霉素生物合成中重要的雙鐵芳胺加氧酶CmlI的O₂活化中間體結(jié)構(gòu)（圖2，左）。在后續(xù)黃素雙鐵蛋白Tm FDP活化還原NO的反應(yīng)中（Angew. Chem. Int. Ed. 2019, 58, 3795-3799），他們用類似的多尺度模擬策略，首次揭示了黃素雙鐵蛋白中關(guān)鍵的雙亞硝基中間體的第二配位層效應(yīng)，及其對NO還原的重要影響（圖2，右），從而將多尺度模擬方法的適用范圍從確定O₂活化過程第一配位層結(jié)構(gòu)，成功拓展到探究NO活化過程第二配位層結(jié)構(gòu)，為該類多尺度理論計算模擬方法在雙核鐵酶體系中更廣泛的應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。 

圖2 通過理論計算預(yù)測得到雙鐵芳胺加氧酶CmlI中O₂活化中間體結(jié)構(gòu)（左），以及黃素雙鐵蛋白Tm FDP中NO活化中間體結(jié)構(gòu)與反應(yīng)機制（右） 

最近，針對氯霉素生物合成中的第一步轉(zhuǎn)化，即雙鐵羥化酶CmlA催化對氨基苯丙氨酸（L-PAPA）底物b位C(sp³)-H鍵羥基化反應(yīng)，利用多尺度QM/MM模擬，陳輝研究員團隊首次揭示了其既不同于sMMO，也不同于T4MO的O₂活化新機制(圖3)。研究發(fā)現(xiàn)，CmlA底物L-PAPA中待羥化的b位C(sp³)-H鍵鄰位上自帶的氨基，通過N-O成鍵，可以協(xié)助O₂活化中O-O鍵發(fā)生異裂。這種氨基輔助的O₂活化機制，產(chǎn)生了雙三價Fe₂^IIIO中間體作為CmlA中真正的C(sp³)-H羥基化活性中間體，與雙鐵C(sp³)-H羥化酶sMMO中菱形雙四價Fe₂^IVO₂中間體Q存在本質(zhì)的不同。由于CmlA中O₂活化時O-O鍵必須先發(fā)生斷裂，這在機制上也與雙鐵C(sp²)-H羥化酶T4MO完全不同。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，O₂活化過程中形成的N-O鍵，在C(sp³)-H羥化完成后，可以逆向發(fā)生斷裂，從而使底物中的氨基得以再生，最終使氨基達到無痕協(xié)助O₂活化的效果。最后，研究中發(fā)現(xiàn)的雙鐵第一配位層橋式羥基在O₂配位后的重組現(xiàn)象，也為今后研究相關(guān)雙鐵加氧酶O₂活化過程中發(fā)現(xiàn)新結(jié)構(gòu)與機制提供了可能性。相關(guān)結(jié)果發(fā)表于Angew. Chem. Int. Ed. 2022, 61, e202211843。 

圖3 理論計算揭示雙鐵羥化酶CmlA中獨特的底物氨基輔助O₂活化機制