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由于免疫測定具有高靈敏度和選擇性，使它們對于檢測不同應用中的不同生物分子特別有用。傳統的免疫傳感器基于三明治測定形式，將兩種抗體結合到目標分析物的不同區域，并將特定識別抗體轉換為物理上可檢測的電子或光學信號。通常通過用化學試劑修飾換能器表面來實現捕獲抗體受體與信號轉導的結合。作者報道了一種新的生物電子親和傳感策略，該策略將天然細胞膜作為識別層，作為傳統免疫測定中有吸引力的抗體受體替代品。細胞膜涂層技術構成了一種能夠在合成材料或設備上復制細胞膜的豐富生物功能的強大策略。天然細胞膜涂層保留了細胞膜上膜蛋白和脂質，因此賦予涂層裝置具有與生物系統交互的獨特性能，包括捕獲和分離生物靶標以及阻止非特異性吸附。

在這項工作中，作者衍生了巨噬細胞膜，將它們涂在電化學傳感器上，并檢查了它們在檢測膜親和性生物分子方面的性能（圖1A）。由于腫瘤壞死因子-α (TNF-α) 在許多炎癥性疾病中發揮著重要作用，因此作者選擇其作為模型分析物。在該仿生平臺中，TNF-α的特異性檢測依賴于巨噬細胞膜識別層上的天然TNF-α受體和辣根過氧化物酶（HRP）標記的抗TNF-α檢測抗體（HRP-Ab）。為了防止非特異性結合，作者進一步將巨噬細胞膜與紅細胞膜融合，并使用混合膜對傳感器進行功能化。具體來說，混合細胞膜功能化的金電極芯片用于基于單樣品孵育的TNF-α親和力測定，其中靶細胞因子被細胞膜上TNF-α受體選擇性捕獲，隨后被HRP-Ab標記。這種三明治模式的細胞膜實驗采用3,3',5,5'-四甲基聯苯胺 (TMB)/H₂O₂作為介體/底物氧化還原檢測系統。在靶標TNF-α存在下，被捕獲的HRP酶在H₂O₂的支持下催化TMB氧化，隨后被氧化的TMB通過電化學還原反應恢復到原始狀態。實驗得到的還原電流與傳感器表面捕獲的HRP-Ab量相關，同時還與目標TNF-α的水平成正比。為了區分空白與目標TNF-α，常用的TMB/HRP/ H₂O₂比色法需要幾分鐘氧化溶液中的TMB；然而，在電流分析中， 在施加恒定電位（-0.1 V）150秒后，氧化的TMB被選擇性地還原。在這種檢測過程中，結合在傳感器表面的HRP-Ab會迅速氧化TMB，進而促進電化學信號變化。作者通過蛋白質印跡分析證實了巨噬細胞膜上存在TNF-α受體（圖 1B )。如圖C，傳感器對10 nM的TNF-α具有超靈敏和選擇性的檢測，而對過量(300nM)的其它細胞因子的響應可忽略不計，并能夠檢測低至500 pM的TNF-α。

圖1. 基于細胞膜的TNF-α 檢測的生物電子親和傳感器。(圖片來源：J. Am. Chem. Soc.)

作者通過三步制備了基于細胞膜的生物電子傳感器芯片（圖2A）。首先，將純化的紅細胞和巨噬細胞膜超聲，并融合生成混合膜囊泡。隨后，為了在工作電極區域產生均勻的生物膜涂層（不覆蓋參考電極），將調整體積后的囊泡30 mL懸浮液滴鑄到鍍金電極上。此外，作者還通過調整囊泡負載和混合膜涂層組成，探索了巨噬細胞/紅細胞混合膜的協同功能?？紤]到包括TNF-α在內的許多血清蛋白都含有巰基，可以與傳感器芯片表面進行非特異性結合，導致假陽性信號。為了抑制非特異性結合，作者使用紅細胞膜衍生囊泡覆蓋電極，并通過優化細胞膜負載有效實現抗生物污染的效果（圖2B）。 在PBB（含有1%BSA的磷酸鹽緩沖液）溶液中，用計時安培法評估金表面HRP-Ab和TNF-α蛋白的非特異性吸附水平。在沒有和存在高濃度TNF-α的情況下，測試了未涂層和涂有不同RBC膜濃度的傳感器芯片性能。結果顯示，當金表面涂覆大量的膜，可以更好地防止不需要的蛋白質吸附。0.05 mg/mL（1.5μg）的膜負荷能夠使最小附著量HRP Ab和TNF-α蛋白所產生的信號空白（S/B）比值變化到達平臺。接下來，優化兩種膜的混合比例，用于高靈敏度檢測細胞因子（圖2C）。具體來說，在沒有和存在100 nM的TNF-α情況下，測量了生物傳感器上混合膜涂層的中兩種膜的比例從0:1（100%RBC）到1:0（100%巨噬細胞）時，S/B比率值的變化，這是由于巨噬細胞含有TNF-α受體，隨著巨噬細胞的增加，更多的TNF-α/HRP-Ab結合物被捕捉到傳感器表面上，導致其敏感性增加（圖2C）。因此，作者選擇巨噬細胞/紅細胞膜比為3:1的混合細胞膜制備TNF-α生物傳感器，該傳感器包含足夠數量的TNF-α受體用于檢測，以及足夠數量的紅細胞膜用于防止非特異性吸附。

圖2. MΦ/RBC混合膜涂層生物電子傳感器芯片的制造和優化。(圖片來源：J. Am. Chem. Soc.)

作者使用雙熒光圖像來驗證金電極表面上的囊泡融合（圖3A）。實驗分別使用DiI和DiO標記巨噬細胞和紅細胞膜，結果表明在金片上形成了高度均勻的混合細胞膜涂層。此外，SEM表征進一步驗證裸金電極表面通過滴注法形成細胞膜涂層的穩定性（圖3B）。結果表明，與粒狀金表面相比，生物膜表面覆蓋率更高。隨后，對不同的細胞膜涂層方法進行檢測，通過使用高電荷轉移電阻值證實滴注法是最有效的方法（圖3C）。在評估操作特性后，對生物電子芯片的制造及TNF-α的生物檢測重復性通過比較五個獨立測量5 nM TNF-α計時安培標準值進行評估（圖3D）。為了調查細胞膜涂層芯片的物理特性，作者通過AFM分析研究了細胞膜涂層的形態（圖3E），觀察到混合膜涂層的平均厚度約為50 nm。

圖3. 混合細胞膜生物電子傳感器芯片的表征。(圖片來源：J. Am. Chem. Soc.)

在優化生物膜組成后，作者測試了混合膜涂層生物電子傳感器對不同的納米級濃度TNF-α的檢測能力。首先使用PBB培養基對生物傳感器的靈敏度進行評估。實驗檢測了不同孵育時間下，不同濃度TNF-α的響應信號（圖4A）。隨后構建了TNF-α校準曲線（R²=0.9985），證實了基于細胞膜生物傳感器可以在5分鐘內快速捕獲TNF-α并產生可測量的信號。作者還評估TNF-α檢測傳感器的選擇性，研究了其他細胞因子對電流信號的影響。結果證實，修飾的生物膜有足夠的TNF-α結合位點，因此，檢測不受高IL-6濃度的影響。同時，作者證實了該傳感器可以在多細胞因子樣本矩陣中實現對TNF-β細胞因子的選擇性檢測（圖4B）。

圖4. 緩沖溶液中TNF-α的校正曲線。(圖片來源：J. Am. Chem. Soc.)