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JACS: 使用細(xì)胞膜作為識(shí)別層構(gòu)建超靈敏選擇性的生物電子親和傳感器

來源：化學(xué)加原創(chuàng)      2022-10-12
導(dǎo)讀：近日，美國(guó)加州大學(xué)圣地亞哥分校納米工程與化學(xué)工程系Joseph Wang、Liangfang Zhang 團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種獨(dú)特的生物電子親和傳感器。該傳感器使用天然細(xì)胞膜作為蛋白質(zhì)檢測(cè)和防止生物污染的識(shí)別層。具體來說，作者采用人類巨噬細(xì)胞(MΦ)膜和人類紅細(xì)胞(RBC)膜通過一步工藝涂覆電化學(xué)傳感器。MΦ膜上天然蛋白質(zhì)受體用于捕獲目標(biāo)抗原，同時(shí)，紅細(xì)胞膜能夠有效的阻止非特異性表面結(jié)合。該傳感器還可檢測(cè)腫瘤壞死因子α (TNF-α)細(xì)胞因子，檢測(cè)限150 pM。
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由于免疫測(cè)定具有高靈敏度和選擇性，使它們對(duì)于檢測(cè)不同應(yīng)用中的不同生物分子特別有用。傳統(tǒng)的免疫傳感器基于三明治測(cè)定形式，將兩種抗體結(jié)合到目標(biāo)分析物的不同區(qū)域，并將特定識(shí)別抗體轉(zhuǎn)換為物理上可檢測(cè)的電子或光學(xué)信號(hào)。通常通過用化學(xué)試劑修飾換能器表面來實(shí)現(xiàn)捕獲抗體受體與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的結(jié)合。作者報(bào)道了一種新的生物電子親和傳感策略，該策略將天然細(xì)胞膜作為識(shí)別層，作為傳統(tǒng)免疫測(cè)定中有吸引力的抗體受體替代品。細(xì)胞膜涂層技術(shù)構(gòu)成了一種能夠在合成材料或設(shè)備上復(fù)制細(xì)胞膜的豐富生物功能的強(qiáng)大策略。天然細(xì)胞膜涂層保留了細(xì)胞膜上膜蛋白和脂質(zhì)，因此賦予涂層裝置具有與生物系統(tǒng)交互的獨(dú)特性能，包括捕獲和分離生物靶標(biāo)以及阻止非特異性吸附。
在這項(xiàng)工作中，作者衍生了巨噬細(xì)胞膜，將它們涂在電化學(xué)傳感器上，并檢查了它們?cè)跈z測(cè)膜親和性生物分子方面的性能（圖1A）。由于腫瘤壞死因子-α (TNF-α) 在許多炎癥性疾病中發(fā)揮著重要作用，因此作者選擇其作為模型分析物。在該仿生平臺(tái)中，TNF-α的特異性檢測(cè)依賴于巨噬細(xì)胞膜識(shí)別層上的天然TNF-α受體和辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗TNF-α檢測(cè)抗體（HRP-Ab）。為了防止非特異性結(jié)合，作者進(jìn)一步將巨噬細(xì)胞膜與紅細(xì)胞膜融合，并使用混合膜對(duì)傳感器進(jìn)行功能化。具體來說，混合細(xì)胞膜功能化的金電極芯片用于基于單樣品孵育的TNF-α親和力測(cè)定，其中靶細(xì)胞因子被細(xì)胞膜上TNF-α受體選擇性捕獲，隨后被HRP-Ab標(biāo)記。這種三明治模式的細(xì)胞膜實(shí)驗(yàn)采用3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺 (TMB)/H2O2作為介體/底物氧化還原檢測(cè)系統(tǒng)。在靶標(biāo)TNF-α存在下，被捕獲的HRP酶在H2O2的支持下催化TMB氧化，隨后被氧化的TMB通過電化學(xué)還原反應(yīng)恢復(fù)到原始狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)得到的還原電流與傳感器表面捕獲的HRP-Ab量相關(guān)，同時(shí)還與目標(biāo)TNF-α的水平成正比。為了區(qū)分空白與目標(biāo)TNF-α，常用的TMB/HRP/ H2O2比色法需要幾分鐘氧化溶液中的TMB；然而，在電流分析中， 在施加恒定電位（-0.1 V）150秒后，氧化的TMB被選擇性地還原。在這種檢測(cè)過程中，結(jié)合在傳感器表面的HRP-Ab會(huì)迅速氧化TMB，進(jìn)而促進(jìn)電化學(xué)信號(hào)變化。作者通過蛋白質(zhì)印跡分析證實(shí)了巨噬細(xì)胞膜上存在TNF-α受體（圖 1B )。如圖C，傳感器對(duì)10 nM的TNF-α具有超靈敏和選擇性的檢測(cè)，而對(duì)過量(300nM)的其它細(xì)胞因子的響應(yīng)可忽略不計(jì)，并能夠檢測(cè)低至500 pM的TNF-α。
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圖1. 基于細(xì)胞膜的TNF-α 檢測(cè)的生物電子親和傳感器。(圖片來源：J. Am. Chem. Soc.)
作者通過三步制備了基于細(xì)胞膜的生物電子傳感器芯片（圖2A）。首先，將純化的紅細(xì)胞和巨噬細(xì)胞膜超聲，并融合生成混合膜囊泡。隨后，為了在工作電極區(qū)域產(chǎn)生均勻的生物膜涂層（不覆蓋參考電極），將調(diào)整體積后的囊泡30 mL懸浮液滴鑄到鍍金電極上。此外，作者還通過調(diào)整囊泡負(fù)載和混合膜涂層組成，探索了巨噬細(xì)胞/紅細(xì)胞混合膜的協(xié)同功能。考慮到包括TNF-α在內(nèi)的許多血清蛋白都含有巰基，可以與傳感器芯片表面進(jìn)行非特異性結(jié)合，導(dǎo)致假陽(yáng)性信號(hào)。為了抑制非特異性結(jié)合，作者使用紅細(xì)胞膜衍生囊泡覆蓋電極，并通過優(yōu)化細(xì)胞膜負(fù)載有效實(shí)現(xiàn)抗生物污染的效果（圖2B）。 在PBB（含有1%BSA的磷酸鹽緩沖液）溶液中，用計(jì)時(shí)安培法評(píng)估金表面HRP-Ab和TNF-α蛋白的非特異性吸附水平。在沒有和存在高濃度TNF-α的情況下，測(cè)試了未涂層和涂有不同RBC膜濃度的傳感器芯片性能。結(jié)果顯示，當(dāng)金表面涂覆大量的膜，可以更好地防止不需要的蛋白質(zhì)吸附。0.05 mg/mL（1.5μg）的膜負(fù)荷能夠使最小附著量HRP Ab和TNF-α蛋白所產(chǎn)生的信號(hào)空白（S/B）比值變化到達(dá)平臺(tái)。接下來，優(yōu)化兩種膜的混合比例，用于高靈敏度檢測(cè)細(xì)胞因子（圖2C）。具體來說，在沒有和存在100 nM的TNF-α情況下，測(cè)量了生物傳感器上混合膜涂層的中兩種膜的比例從0:1（100%RBC）到1:0（100%巨噬細(xì)胞）時(shí)，S/B比率值的變化，這是由于巨噬細(xì)胞含有TNF-α受體，隨著巨噬細(xì)胞的增加，更多的TNF-α/HRP-Ab結(jié)合物被捕捉到傳感器表面上，導(dǎo)致其敏感性增加（圖2C）。因此，作者選擇巨噬細(xì)胞/紅細(xì)胞膜比為3:1的混合細(xì)胞膜制備TNF-α生物傳感器，該傳感器包含足夠數(shù)量的TNF-α受體用于檢測(cè)，以及足夠數(shù)量的紅細(xì)胞膜用于防止非特異性吸附。
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圖2. MΦ/RBC混合膜涂層生物電子傳感器芯片的制造和優(yōu)化。(圖片來源：J. Am. Chem. Soc.)
作者使用雙熒光圖像來驗(yàn)證金電極表面上的囊泡融合（圖3A）。實(shí)驗(yàn)分別使用DiI和DiO標(biāo)記巨噬細(xì)胞和紅細(xì)胞膜，結(jié)果表明在金片上形成了高度均勻的混合細(xì)胞膜涂層。此外，SEM表征進(jìn)一步驗(yàn)證裸金電極表面通過滴注法形成細(xì)胞膜涂層的穩(wěn)定性（圖3B）。結(jié)果表明，與粒狀金表面相比，生物膜表面覆蓋率更高。隨后，對(duì)不同的細(xì)胞膜涂層方法進(jìn)行檢測(cè)，通過使用高電荷轉(zhuǎn)移電阻值證實(shí)滴注法是最有效的方法（圖3C）。在評(píng)估操作特性后，對(duì)生物電子芯片的制造及TNF-α的生物檢測(cè)重復(fù)性通過比較五個(gè)獨(dú)立測(cè)量5 nM TNF-α計(jì)時(shí)安培標(biāo)準(zhǔn)值進(jìn)行評(píng)估（圖3D）。為了調(diào)查細(xì)胞膜涂層芯片的物理特性，作者通過AFM分析研究了細(xì)胞膜涂層的形態(tài)（圖3E），觀察到混合膜涂層的平均厚度約為50 nm。
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圖3. 混合細(xì)胞膜生物電子傳感器芯片的表征。(圖片來源：J. Am. Chem. Soc.)
在優(yōu)化生物膜組成后，作者測(cè)試了混合膜涂層生物電子傳感器對(duì)不同的納米級(jí)濃度TNF-α的檢測(cè)能力。首先使用PBB培養(yǎng)基對(duì)生物傳感器的靈敏度進(jìn)行評(píng)估。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了不同孵育時(shí)間下，不同濃度TNF-α的響應(yīng)信號(hào)（圖4A）。隨后構(gòu)建了TNF-α校準(zhǔn)曲線（R2=0.9985），證實(shí)了基于細(xì)胞膜生物傳感器可以在5分鐘內(nèi)快速捕獲TNF-α并產(chǎn)生可測(cè)量的信號(hào)。作者還評(píng)估TNF-α檢測(cè)傳感器的選擇性，研究了其他細(xì)胞因子對(duì)電流信號(hào)的影響。結(jié)果證實(shí)，修飾的生物膜有足夠的TNF-α結(jié)合位點(diǎn)，因此，檢測(cè)不受高IL-6濃度的影響。同時(shí)，作者證實(shí)了該傳感器可以在多細(xì)胞因子樣本矩陣中實(shí)現(xiàn)對(duì)TNF-β細(xì)胞因子的選擇性檢測(cè)（圖4B）。
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圖4. 緩沖溶液中TNF-α的校正曲線。(圖片來源：J. Am. Chem. Soc.)

總結(jié)

作者通過實(shí)驗(yàn)證明使用天然細(xì)胞膜作為識(shí)別層，構(gòu)建的生物膜涂層電化學(xué)傳感器能夠?qū)NF-α細(xì)胞因子進(jìn)行高度特異、靈敏和快速檢測(cè)。該傳感器在復(fù)雜體液或高濃度細(xì)胞因子環(huán)境中，對(duì)不同痕量的TNF-α具有良好的分析性能。實(shí)驗(yàn)表明，在傳感器制備過程中，巨噬細(xì)胞膜上表達(dá)的TNF-α受體的完整性和功能性以及紅細(xì)胞膜的抗生物污染性被很好的保留下來。不同細(xì)胞類型的多樣性和獨(dú)特功能為開發(fā)具有廣泛應(yīng)用的仿生傳感平臺(tái)提供了相當(dāng)大的前景，為生物傳感器的應(yīng)用新領(lǐng)域鋪平了道路。


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