欧美色盟,色婷婷AV一区二区三区之红樱桃,亚洲精品无码一区二区三区网雨,中国精品视频一区二区三区

液相多肽合成（LPPS）還是固相多肽合成（SPPS）?這是多肽工業(yè)化學(xué)家在工藝開發(fā)前都會(huì)問到的問題。這兩種合成策略都有著各自天然的優(yōu)勢(shì)與劣勢(shì)。液相多肽合成適合大體量的多肽藥物或者多肽化妝品的生產(chǎn)，在生產(chǎn)規(guī)模和生產(chǎn)成本上都有明顯的優(yōu)勢(shì)，但它的工藝開發(fā)比較復(fù)雜，生產(chǎn)周期較長，需要結(jié)晶或者純化中間體，而這些問題卻都是固相合成的優(yōu)勢(shì)所在。

所謂的多肽制備第三波，是建立在多肽合成兩大傳統(tǒng)策略的基礎(chǔ)之上而闡述的 (圖1)：第一波: Classic solution peptide synthesis (傳統(tǒng)液相多肽合成，CSPS)，意指諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)得主，Bruce Merrifeld教授在上世紀(jì)60年代發(fā)明固相多肽合成之前，業(yè)界人士所采用的液相多肽合成策略。第二波：SPPS (固相多肽合成)。

圖1. 上世紀(jì)以來多肽化學(xué)發(fā)展圖譜（圖片來源：Chem. Rev.）

盡管固相合成方法在目前的工業(yè)界大行其道，但其也存在不可逾越的自身缺點(diǎn)，比如需要使用過量的試劑與溶劑。從綠色化學(xué)的角度來看，液相合成被重新加以重視。不同于經(jīng)典的液相多肽合成，如今的液相手段增加了可溶性C-端標(biāo)簽（Tag）策略，類似于樹脂，將增長的多肽鏈固化其上。但因?yàn)闃?biāo)簽巨大的親脂性，形成的多肽-標(biāo)簽加合物可以溶于有機(jī)溶劑，并且溶解性顯著異于試劑和副產(chǎn)物，可以通過簡單的沉淀、過濾或萃取得到這些多肽-標(biāo)簽的加合物中間體，從而實(shí)現(xiàn)類似于固相合成的洗脫法去除過量試劑和副產(chǎn)品的目的。LPPS可以公斤或噸級(jí)規(guī)模生產(chǎn)，可以自動(dòng)化，生產(chǎn)過程中的能量輸入低；勞動(dòng)力少；能源和材料消耗成本低。

近年來，液相多肽合成的C-端標(biāo)簽的發(fā)展實(shí)現(xiàn)了飛躍，通過全氟烷基、離子液體、聚碳、疏水聚合物和含磷標(biāo)簽，從多分散聚乙二醇 (PEG) 到單分散 PEG。Albericio的這篇綜述涵蓋了以下范疇：(i) 基于 PEG 的肽合成； (ii) 膜技術(shù)支持的肽合成；(iii) 氟技術(shù)； (iv) 離子液體 (IL)； (v)聚碳化合物； (vi) 疏水聚合物 (圖 2)。 每個(gè)部分涵蓋肽合成的最通用方案，包括肽的規(guī)模、產(chǎn)量和純度。

 圖2. 液相多肽合成的各種策略（圖片來源：Chem. Rev.）

2. PEG標(biāo)簽LPPS

在 PEG-LPPS 中，PEG 類型的標(biāo)簽在二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、甲苯、乙腈 (ACN)和水中具有較高的溶解度，但難溶于叔丁基甲基醚(MTBE)，乙醚(DEE)、己烷和異丙醇(IPA)。這種溶解度的差異可以為肽-PEG LPPS技術(shù)所利用，通過沉淀或過濾的方法純化中間體，并可以在肽增長過程中洗滌掉不需要的試劑和副產(chǎn)物。LPPS 的常用PEG標(biāo)簽如圖 3 所示。

圖3. LPPS的常用PEG類型標(biāo)簽結(jié)構(gòu)（圖片來源：Chem. Rev.）

C-端肽羧酸的PEG 標(biāo)簽包括，PEG14-PEG15 ，類似于 Wang 樹脂（使用高濃度TFA 切割），PEG16（trityl 手臂）和 PEG17（二苯甲基手臂），后兩者可以使用低濃度的TFA進(jìn)行切割。 應(yīng)用于C-端酰胺肽的標(biāo)簽包括，PEG18（Rink  amide手臂）和PEG19（BAL 手臂），用高濃度TFA切割。 這些PEG-LPPS標(biāo)簽與以前在SPPS中使用的任何手臂都相吻合。

如同SPPS一樣，最先應(yīng)用于PEG標(biāo)簽LPPS技術(shù)的也是Boc/Bzl 化學(xué)。本世紀(jì)初，適用于Fmoc/tBu的相應(yīng)技術(shù)逐漸流行開來，分子量5000的PEG標(biāo)簽被使用在這一過程中。每一個(gè)氨基酸縮合步驟得到的多肽-標(biāo)簽中間品通過乙醚沉淀的方式得到分離。標(biāo)簽切割則通過TFA溶液得以實(shí)現(xiàn)。Fmoc 的去保護(hù)可以通過TBAF·H₂O /1-辛硫醇(捕獲試劑)的 DMF 溶液實(shí)現(xiàn)，或者使用常規(guī)的20% piperidine/DMF溶液處理。中間品在乙醚中沉淀，并使用MTBE、異丙醇和乙醚進(jìn)行淋洗。氨基酸縮合則由PyBOP或TPTU介導(dǎo)，在HOAt/DIPEA的存在下完成。在TFA切割和整體去保護(hù)后，PEG可在硅膠柱上通過固相萃取的方法上分離，使用DCM/DEE 或者 DCM/MeOH做為洗脫液，得到最終的多肽產(chǎn)物。PEG-標(biāo)簽LPPS的技術(shù)特點(diǎn)歸納見表1。

表1. 多分散PEG-標(biāo)簽LPPS路線的特征歸納

3. 膜技術(shù)LPPS（MEMBRANE-ENHANCED PEPTIDE SYNTHESIS，MEPS)

膜技術(shù)多肽合成MEPS本質(zhì)上是PEG-標(biāo)簽LPPS的一個(gè)衍生技術(shù)，反應(yīng)中的試劑通過有機(jī)溶劑納米過濾(OSN)的方法實(shí)現(xiàn)與多肽中間產(chǎn)物的分離。有機(jī)溶劑納米過濾依靠壓力動(dòng)力過濾的方式分離溶液中的分子（分子量200-2000 kDa）。過濾膜可以是聚合物 (Vicote PEEK, DuraMem 500, DuraMem 900)，也可以是陶瓷材質(zhì) (Inopore 450 或 Inopore 750)。溶質(zhì)截留和滲透通量兩個(gè)參數(shù)決定了膜的選取。膜功效由截留分子量（MWCO）表征，高于MWCO的溶質(zhì)分子可以獲得超過90%的溶質(zhì)截留。MEPS路線通常使用分子量2000-8000的PEG作為標(biāo)簽，標(biāo)簽可以是線性結(jié)構(gòu)，也可以是球形結(jié)構(gòu)。支鏈球形標(biāo)簽可以獲得更高的溶質(zhì)截留。通常來說，MEPS合成策略分為以下幾個(gè)步驟：1）酰胺聚合反應(yīng)；2）使用定容滲濾（CVD）的方法洗滌反應(yīng)液；3）Fmoc去保護(hù)；4）再次使用CVD洗滌反應(yīng)液。圖4顯示了這四個(gè)步驟。目標(biāo)多肽縮合完畢后，使用切割液進(jìn)行切割和去保護(hù)。

MEPS的兩種方案在圖4中系統(tǒng)顯示。第一種方案執(zhí)行兩次滲濾（一次在氨基酸縮合后，另一次在Fmoc去保護(hù)后，圖4（1））。第二種方案（PEPSTAR）僅在Fmoc去保護(hù)后進(jìn)行滲濾操作（圖4（2））。圖5總結(jié)了MEPS方案中常用的PEG標(biāo)簽的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

圖4. MEPS多肽合成路線圖（I）雙滲濾方案；（2）單滲濾方案（PEPSTAR）（圖片來源：Chem. Rev.）

圖5. MEPS常用可溶性標(biāo)簽（圖片來源：Chem. Rev.）

在一項(xiàng)五肽H-Tyr-Ala-Tyr-Ala-Tyr-OH 和 H-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH 的MEPS合成中，MEPS1（4-(羥甲基)苯氧乙酸）被使用做標(biāo)簽。第一個(gè)氨基酸與標(biāo)簽的縮合酯化反應(yīng)通過DIC/HOBt在DMF中完成（15分鐘預(yù)活化，2小時(shí)縮合）。過量的試劑通過10體積的CVD被排除出反應(yīng)體系。20% piperidine/DMF 30分鐘去Fmoc保護(hù)基，接下來是12體積的CVD。氨基酸縮合由PyBOP控制并在1小時(shí)內(nèi)完成，緊接著進(jìn)行滲濾步驟。如此的縮合→CVD→Fmoc去保護(hù)→CVD的循環(huán)進(jìn)行多輪反復(fù)，直到目標(biāo)多肽合成完畢。多肽-MEPS1復(fù)合物首先在乙醚中沉淀分離，然后使用TFA/苯酚/水（10：0.7：1）進(jìn)行3小時(shí)的切割和去保護(hù)。多肽產(chǎn)物再次在乙醚中沉淀分離，并用液相色譜純化。兩個(gè)5肽的總體產(chǎn)率均為94%。而在PEPSTAR策略中，執(zhí)行的是氨基酸縮合 →Fmoc去保護(hù) → CVD的循環(huán)。 

4. 氟標(biāo)簽LPPS

全氟烷基標(biāo)簽可以同時(shí)具有親氟性，親脂性，和疏水性的特征。這些屬性使得氟標(biāo)簽易于從水相或有機(jī)相中得到分離，并應(yīng)用于LPPS。一旦反應(yīng)進(jìn)行，這些氟標(biāo)簽(輕含氟物或重含氟物)可以比較容易地通過氟固相萃取（F-SPE）或含氟液-液萃取（FLLE）的方式與其他非氟化合物分離。這種分離的概念展現(xiàn)于圖6。常用的氟標(biāo)簽總結(jié)在圖7中。

圖6. 通過A) 輕含氟物的氟固相萃取（F-SPE）和B)重含氟物的含氟液-液萃取（FLLE）的方式實(shí)現(xiàn)純化效果的概念圖（圖片來源：Chem. Rev.）

FTAG3 被用作促甲狀腺素釋放激素(pGlu-His-Pro-NH₂)的LPPS的氟標(biāo)簽。5% piperidine/FC72-DMF (FC72是全氟己烷，與有機(jī)溶劑和水都不互溶)完成Fmoc去保護(hù)。反應(yīng)溶液用檸檬酸水溶液和NaHCO₃水溶液洗滌。氨基酸縮合反應(yīng)使用PyBOP作為縮合試劑，并使用C₄F₉OEt/DMF作為溶劑。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)體系用MeOH萃取。中間體多肽-標(biāo)簽在FC72相中，并進(jìn)入下一輪的Fmoc去保護(hù)和氨基酸縮合循環(huán)。縮合好的多肽被TFA/H₂O/1,4-丁二硫醇切割去保護(hù)。反應(yīng)體系分為FC72, 水，和甲苯三相，多肽進(jìn)入水相，經(jīng)過液相色譜純化后得到最終產(chǎn)品， 產(chǎn)率為62%。氟標(biāo)簽進(jìn)入FC72相，有機(jī)試劑則進(jìn)入甲苯相。

圖7. 常用的氟標(biāo)簽化學(xué)結(jié)構(gòu)（圖片來源：Chem. Rev.）

5. 離子液體標(biāo)簽LPPS

離子液體也可以作為標(biāo)簽在液相多肽合成中使用，該綜述列舉了圖8中的幾種常見的離子液體LPPS標(biāo)簽。

圖8. 常見的離子液體LPPS標(biāo)簽（圖片來源：Chem. Rev.）

6. 碳基標(biāo)簽LPPS

長脂肪鏈的存在可以顯著增加多肽-標(biāo)簽的疏水性，而這種高疏水性可以不受多肽鏈增長影響，因此，以長脂肪鏈為基質(zhì)的標(biāo)簽也在LPPS中得到了應(yīng)用。這些碳基標(biāo)簽可以在諸如乙腈或甲醇的極性溶劑中沉淀，因此為中間品在氨基酸縮合和Fmoc 去保護(hù)的分離提取提供了基礎(chǔ)，這種過程被成為沉淀/萃取過程（precipitation/extraction）。常用的碳基LPPS標(biāo)簽如圖9所示。圖10顯示了碳基標(biāo)簽LPPS的流程示意。

圖9. 常用碳基LPPS標(biāo)簽化學(xué)結(jié)構(gòu)（圖片來源：Chem. Rev.）

圖10. 碳基標(biāo)簽法介導(dǎo)的LPPS示意圖。（圖片來源：Chem. Rev.）

以PC1為例，苯環(huán)上的給電子基團(tuán)可以增加多肽與標(biāo)簽之間的酸敏感性（穩(wěn)定酯鍵酸解后芐基陽離子），而拉電子基團(tuán)則增加其穩(wěn)定性。第一個(gè)氨基酸縮合到標(biāo)簽的酯化反應(yīng)由EDC-HOBt-三乙胺（2當(dāng)量）的DCM溶液實(shí)現(xiàn)。反應(yīng)液在經(jīng)過鹽水萃取后，有機(jī)相由MgSO₄干燥并在甲醇中沉淀分離。得到的產(chǎn)物溶解于DCM,并加入piperidine脫Fmoc。反應(yīng)結(jié)束后加入甲醇，沉淀H-AA-O-PC1產(chǎn)物。接下來Fmoc-Xaa-OH/EDC/HOBt (1:1.1:1, 2 當(dāng)量) 的DCM溶液進(jìn)行氨基酸縮合反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液先經(jīng)鹽水萃取，有機(jī)相干燥并在甲醇中沉淀。這樣的脫Fmoc/氨基酸縮合的循環(huán)一直進(jìn)行到多肽的縮合完畢。切割和去保護(hù)由4 N HCl/乙醇溶液過夜反應(yīng)完成。溶劑被真空蒸干，殘留物經(jīng)正己烷沉淀后得到目標(biāo)產(chǎn)物Fmoc-Leu-Phe-Ala-OH。圖11展示了碳基標(biāo)簽法LPPS的中間品分離過程。除了DCM之外，THF或者THF/DMF (9:1)也可以作為氨基酸縮合或脫Fmoc的溶劑，而乙腈也常被用作沉淀中間品的反溶劑。對(duì)于在合成過程中容易產(chǎn)生分子間聚合，從而引發(fā)反應(yīng)溶液粘稠并降低縮合效率的情況，也可使用環(huán)己烷/THF的混合液作為溶劑。在這種情況下，氨基酸縮合和脫Fmoc將在雙相條件下進(jìn)行。遇到中間品形成凝膠而難以沉淀的情況，可以在反應(yīng)體系中加入矽藻土（diatomite）協(xié)助產(chǎn)物沉淀，沉淀物經(jīng)洗滌后加入非極性溶劑萃取多肽-標(biāo)簽產(chǎn)物，并分離矽藻土。這種策略被研究者命名為“捕獲-釋放”手段（capture and release）。

圖11.碳基標(biāo)簽法LPPS中間品分離示意圖。（圖片來源：Chem. Rev.）

PC4作為標(biāo)簽通過Fmoc/tBu化學(xué)合成了兩個(gè)長肽bivalirudin (H-D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH) 和 h-ghrelin [H-Gly-Ser-Ser(n-octanoyl)-Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-His-Gln-Arg-Val-Gln-Gln-Arg-Lys-Glu-Ser-Lys-Lys-Pro-Pro-Ala-Lys-Leu-Gln-Pro-Arg-OH] （bivalirudin和h-ghrelin分別使用了3和4個(gè)片段進(jìn)行最終的液相片段縮合）。HATU/HOAt/THF在這個(gè)合成中引導(dǎo)了氨基酸縮合反應(yīng), 1% DBU/1% PIP/THF負(fù)責(zé)脫Fmoc反應(yīng)。最終分別以64% 和68%的產(chǎn)率得到了bivalirudin 和 h-ghrelin。

Ajinomoto 公司開發(fā)的PC11-PC12標(biāo)簽，通過脂肪鏈的側(cè)鏈分支，大大增加了標(biāo)簽的疏水性，使得LPPS過程中，中間品的分離擺脫了傳統(tǒng)的沉淀手段，而采用兩相萃取的方式，含有中間品多肽-標(biāo)簽的相直接進(jìn)入下一步的反應(yīng)步驟，從而避免了沉淀，洗滌，重新溶解的步驟，不僅縮短了生產(chǎn)時(shí)間，而且顯著地降低了溶劑的用量。

Degarelix （10肽，C-端酰胺）和bivarulirudin（20肽，C-端羧酸）分別使用PC11和PC12標(biāo)簽, 通過LPPS手段實(shí)現(xiàn)了成功合成。標(biāo)簽-氨基酸偶聯(lián)反應(yīng)：PC11: Fmoc?AA-OH?EDC-HOBt (1.1:1.2:1); PC12: Fmoc?AA-OH?EDC-DMAP (1.3:1.4:0.06)，室溫下過夜反應(yīng)，反應(yīng)溶劑為氯仿。反應(yīng)液經(jīng)過20% NaCl萃取。有機(jī)相加入硫代蘋果酸（作為dibenzofulvene的捕獲劑）/DBU (3:8)，室溫下2小時(shí)脫Fmoc。反應(yīng)液加入甲磺酸后經(jīng)NaHCO₃水溶液 和 DMF萃取以去除脫Fmoc過程中產(chǎn)生的dibenzofulvene加合物。有機(jī)相繼續(xù)用于下一部分反應(yīng)而無需濃縮，干燥或者沉淀。氨基酸縮合反應(yīng)由Fmoc?AA-OH/EDC/HOBt (1.2:1.2:x) (PC11 x=1, PC12 x=0.3)室溫下過夜完成。脫Fmoc和氨基酸縮合就按照以上的循環(huán)進(jìn)行，直至目標(biāo)多肽合成完畢。之后將反應(yīng)液濃縮，并在乙腈中沉淀目標(biāo)多肽-標(biāo)簽加合物。切割和去保護(hù)反應(yīng)通過TFA?TIS?H₂O (95:2.5:2.5)在室溫下2小時(shí)完成。Degarelix和bivalirudin分別獲得89%/84%的粗品純度和85%/79%的產(chǎn)率。硅烷基化的標(biāo)簽PC13在LPPS中可以實(shí)現(xiàn)更低的粘度和更好的疏水效果，可以被用作合成含義有N-甲基氨基酸的復(fù)雜多肽的液相合成。

7. 疏水性聚合物

PEG標(biāo)簽通常受困于較低的負(fù)載率，而且多肽-PEG加合物在中間品分離過程中時(shí)常會(huì)與反應(yīng)試劑產(chǎn)生共沉淀，而無法實(shí)現(xiàn)更好的分離副產(chǎn)品的效果。與此同時(shí)，PEG標(biāo)簽的溶解度也不令人滿意。這種現(xiàn)實(shí)催生了聚降冰片烯類標(biāo)簽的誕生。這類標(biāo)簽具有更高的負(fù)載率和溶解度，相較PEG更適合LPPS的應(yīng)用。其結(jié)果示意圖參見圖12。常見的聚合物類LPPS標(biāo)簽如圖13所示。

圖12. 聚降冰片烯類標(biāo)簽結(jié)構(gòu)參考圖。（圖片來源：Chem. Rev.）

圖13. 常見的聚合物類LPPS標(biāo)簽（圖片來源：Chem. Rev.）

結(jié)論與展望

截至目前，上市的多肽類藥物已經(jīng)超過100種，有將近170種多肽類藥物在不同的臨床階段，并由400-600種處于前臨床期。LPPS所展現(xiàn)的綠色化學(xué)的潛質(zhì)，相比于固相合成來說更有可能成為未來大規(guī)模多肽藥物合成的有效手段。SPPS的PMI (process mass intensity)大約80-90%來源于溶劑的使用，剩余部分則由過量的試劑和樹脂產(chǎn)生。而LPPS在這些領(lǐng)域都具有明顯的優(yōu)勢(shì)，可以顯著地降低由溶劑，過量試劑和樹脂所產(chǎn)生的PMI。

PEG標(biāo)簽可以通過有效的超濾或者沉淀引導(dǎo)LPPS的進(jìn)行，但超濾過程所需的過量溶劑是它無法克服的障礙，所以PEG標(biāo)簽法并未在工業(yè)界中實(shí)現(xiàn)應(yīng)用。膜技術(shù)LPPS(MEPS)解決了PEG的這個(gè)固有問題，可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)性的生產(chǎn)工藝。PEPSTAR技術(shù)的PMI目前與SPPS相當(dāng)，但有望通過優(yōu)化進(jìn)一步降低。

氟標(biāo)簽的有效性取決于標(biāo)簽的含氟量，以及與有機(jī)溶劑和水都不互溶的全氟溶劑FC72的使用。雖然在分子量較小的多肽上取得成功，但對(duì)于大肽來說，氟標(biāo)簽上的氟載量必須增加，以實(shí)現(xiàn)較好的中間品分離，但這對(duì)于目前的氟標(biāo)簽來說難度較大。除此之外，此工藝涉及的氟化試劑和溶劑成本都較高，對(duì)大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用是個(gè)致命的影響因素。

離子液體標(biāo)簽法可以通過使用綠色溶劑的手段體現(xiàn)其優(yōu)勢(shì)，但它們尚未在工業(yè)界中取得廣泛應(yīng)用。

碳基標(biāo)簽可以增加氨基酸的縮合效率以及速率。此項(xiàng)方法目前的最大問題在于需要使用有害溶劑DCM, 氯仿等。Ajiphase工藝實(shí)現(xiàn)了通過萃取的手段去除過量試劑，副產(chǎn)品，而無需沉淀中間產(chǎn)物，這樣可以大大縮短生產(chǎn)時(shí)間并降低溶劑用量。

聚合物標(biāo)簽LPPS是近期涌現(xiàn)出的新選擇，它們可以通過自身結(jié)構(gòu)的改性實(shí)現(xiàn)更高的負(fù)載率和溶解效果。但在工業(yè)界尚未涌現(xiàn)出此技術(shù)的應(yīng)用報(bào)告。