KRAS原癌基因的體細胞突變是人類癌癥中主要的致癌病變。盡管KRAS在歷史上被認為是“undruggable”的靶點，但最近成功開發的共價K-Ras（G12C）配體已經證明了直接、等位基因特異性的K-Ras抑制所帶來的顯著臨床益處。這些K-Ras（G12C）抑制劑利用突變型半胱氨酸的強親核性，不可逆地結合在K-Ras的Switch II區域。然而，K-Ras的許多頻繁發生的體細胞突變不會產生半胱氨酸殘基，而對這些突變體的選擇性靶向仍然是一個未解決的挑戰。但是，在17%的胰腺導管腺癌（PDAC）患者中發現了這種熱點突變之一——KRAS p.G12R。因此，作者推斷，對獲得的精氨酸（Arg12）的共價結合可以賦予效力和選擇性，并能夠直接靶向K-Ras（G12R）。然而，在生理pH值（pKa3 = 12.5）下完全質子化的精氨酸的胍基團是弱親核的。為了實現突變精氨酸的化學選擇性靶向，作者首先考慮了優先與胍或脒反應的官能團。例如，已發現2,3-丁二酮，1,2-環己二酮可選擇性地修飾蛋白質上的精氨酸殘基。雖然這些試劑已被用于研究蛋白質糖基化，非特異性修飾蛋白質并進行生物偶聯反應，但這種反應性尚未用于靶向共價配體。首先，作者合成得到具有α,β-二酮酰胺的化合物3。可能由于α-酮的強親電性，化合物3只能作為水合物分離?；衔?/span>3在一定pH范圍內的水性緩沖液中是穩定的，并且不與常見的含硫醇親核試劑反應。然而，當將100 μM化合物3（分子量 = 674 Da）與重組K-Ras（G12R）GDP（GDP = 鳥苷二磷酸）在pH 7.5和23 °C下孵育并通過蛋白質質譜監測反應時，作者觀察到兩種新蛋白質種類的形成，其分子量與化學計量共價加合物一致，損失一或兩個當量的水（分別為+ 656 Da和+ 638 Da，Fig. 1C）。確認K-Ras Switch-II配體在配備鄰位二羰基系統時與K-Ras（G12R）中的Arg12的反應性。Fig. 1: α,β-二酮酰胺3的合成，與精氨酸殘基反應機理以及K-Ras（G12R）GDP和K-Ras（G12R） GDP 3加合物的全蛋白質質譜。（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）在pH 7.5下延長孵育后，化合物3未能對野生型（WT） K-Ras·GDP（Fig. 2A）或其它熱點突變體產生修飾，包括G12D、G12V、Q61R、Q61K 和 Q61L（Fig. 2B），證實了其與Arg12的選擇性修飾。此外，K-Ras含有幾個表面暴露的精氨酸，它們沒有被化合物3修飾，進一步支持了它對突變精氨酸的選擇性。與該配體骨架對GDP結合狀態的蛋白質偏好一致，化合物3與K-Ras（G12R）GppNHp的反應比較緩慢，72小時的修飾效率為<5%（Fig. 2A）。該反應依賴于pH值，在pH值6時反應速率大幅度降低，在在pH值8時反應速率達到最大值（Fig. 2C）。與未修飾的K-Ras（G12R）GDP相比，K-Ras（G12R）GDP·3加合物的熱穩定性顯著提高（Fig. 2D），熔融溫度升高了9.1 °C，且這種加合物的形成也似乎是不可逆的。Fig. 2: 化合物3的選擇性以及在不同pH條件下的反應速率。（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）為了了解Arg12和α,β-二酮酰胺之間形成的加合物的化學性質，作者得到了K-Ras（G12R）·GDP和化合物4的共晶體（化合物3的結構類似物）。化合物4結合在K-Ras的Switch II口袋中，配體和蛋白質之間的共價鍵具有明確的電子密度（Fig. 3A）。其中，作者驚奇地觀察到了一種咪唑鎓結構，Arg12以其ε和η氮參與“側向”取向。這種咪唑加合物與全蛋白質質譜法揭示的兩個水分子的損失一致（Fig. 1C）。來自η氮的親核加成也似乎是立體選擇性的，因為電子密度清楚地表明叔醇是S-構型（Fig. 3A，B）。與未配位的K-Ras（G12R）GDP相比，Arg12的側鏈向Switch II區域靠攏，Cβ-Cγ-Cδ-Nε二面角由反向左轉（Fig. 3C）。Fig. 3: K-Ras（G12R）GDP·4加合物的晶體結構。（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）此外，為了進一步確認3和Arg12之間的反應是否會導致K-Ras（G12R）的功能性抑制。作者測試了K-Ras（G12R）與3結合前后核苷酸交換活性，發現熒光GDP類似物（BODIPY-GDP）在有Sos蛋白或乙二胺四乙酸(EDTA)的情況下交換未標記的GDP（Fig. 4A）。最后，作者利用K-Ras和3之間反應時分子量的增加在抗Ras免疫印跡上進行展示(Fig. 4B)，驗證了精氨酸靶向親電試劑在復雜蛋白質組中對K-Ras的共價修飾。同時，作者也觀察到化合物3僅能對外源重組蛋白K-Ras（G12R）·GDP實現完全修飾（Fig. 4B），表明了化合物3在細胞裂解物中保持活性，但不能與內源性K-Ras（G12R）結合。主要是由于與已被GDP狀態選擇性配體成功靶向的K-Ras（G12C）不同，K-Ras（G12R）嚴重損害了GTPase活性，從而阻止其轉化為敏感的GDP結合狀態。Fig. 4: (A)Sos蛋白或EDTA介導的K-Ras（G12R）和K-Ras（G12R）3加合物的核苷酸交換。(B)細胞裂解物中內源性和外源性K-Ras（G12R）的共價修飾。（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）
Ziyang Zhang和Kevan M. Shokat團隊使用α,β-二酮酰胺作為優先的精氨酸反應性官能團，確定了K-Ras（G12R）的第一個選擇性突變共價配體。發現這些配體與K-Ras（G12R）產生穩定的咪唑鎓加合物，并使用X-射線晶體學直接觀察到一種此類加合物的結構。作者成功地將其用于設計與復雜蛋白質組中的弱親核精氨酸殘基結合的靶向共價配體，其可以作為治療靶向人類疾病中獲得性精氨酸殘基的基礎。
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