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研究背景—Cas9蛋白遞送的瓶頸

基于CRISPR/Cas9的基因編輯技術(shù)以其特異性高，具備多重基因編輯能力等優(yōu)勢在遺傳性疾病的基因治療中展現(xiàn)了極大的潛力。就在去年，Intellia Therapeutics公司與Regeneron公司合作在新英格蘭醫(yī)學雜志（NEJM）上發(fā)表了第一個基于CRISPR/Cas9的靜脈注射藥物NTLA-2001的1期臨床試驗中期數(shù)據(jù)，顯示包裹Cas9 mRNA/sgATTR（針對轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白點洋洋變性疾病）的脂質(zhì)納米顆粒（Lipid Nanoparticle, LNP）能夠在單次注射后將患者血清中TTR水平下降87%。盡管如此，直接遞送Cas9/sgRNA核糖核蛋白（RNP）而非mRNA仍然具有極強的挑戰(zhàn)性，這包括：1）Cas9/sgRNA RNP具有極大的尺寸，其單復(fù)合物分子量高達近170 kDa，難以被病毒及傳統(tǒng)非病毒材料有效負載；2）Cas9蛋白易降解及變性，Cas9/sgRNA RNP面臨蛋白酶及核酸酶降解的雙重壓力；3）與核酸類藥物類似，Cas9/sgRNA RNP遞送的組織特異性差，遞送效率低。

研究亮點—本文的解決思路

目前，實現(xiàn)肝靶向的主要途徑有以下兩種：1）利用LNP包裹核酸藥物，LNP在進入血液循環(huán)后表面吸附載脂蛋白E（ApoE），ApoE能夠?qū)NP轉(zhuǎn)運到表達低密度脂蛋白受體（LDLR）的肝細胞表面，由LDLR介導LNP內(nèi)吞進入肝細胞中；2）在遞送系統(tǒng)表面修飾半乳糖（Galactose）以靶向肝細胞表達的去唾液酸糖蛋白受體（ASGPR）。然而，無論是使用脂質(zhì)還是在表面修飾半乳糖，都將導致一定程度的免疫原性及肝毒性。為了在實現(xiàn)肝特異性靶向的同時降低免疫原型及毒性，本文作者提出，使用從人肝星狀細胞中分離得到的外泌體為載體，以電穿孔的方式將Cas9/sgRNA RNP負載到外泌體內(nèi)，通過攜帶靶向不同基因的Cas9/sgRNA RNP實現(xiàn)對多種肝臟疾病（如：急性肝損傷、慢性肝纖維化、原位肝癌等）的基因治療。

外泌體的制備及表征

首先，作者選擇了具有高增殖率的非轉(zhuǎn)化人肝星狀細胞LX-2作為外泌體的供體細胞，通過差速離心的方法分離與收集LX-2細胞所分泌的外泌體。收集的外泌體再用超速離心法進一步純化，并經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后得到外泌體重懸液。純化所得的外泌體重懸液與Cas9/sgRNA RNP以5:1（質(zhì)量比）的比例混合，然后通過電穿孔的方法將RNP負載到外泌體內(nèi)部，最后再次通過超速離心法對其進行純化，得到負載RNP的外泌體Exosome^RNP （圖1）。

動態(tài)光散射（DLS）顯示制備所得Exosome^RNP 的粒徑為50至200 nm，透射電子顯微鏡（TEM）下呈現(xiàn)碟形的納米囊泡結(jié)構(gòu)，通過蛋白免疫印跡法（western blot）計算，Exosome^RNP的Cas9蛋白包封率約為20%。細胞水平實驗表明，Exosome^RNP能夠有效的將Cas9 RNP遞送到人肝星狀細胞（LX-2）及人肝癌細胞（Huh-7）的細胞質(zhì)與細胞核中，并成功對多個疾病的靶基因進行了敲除。此外，小鼠體內(nèi)實驗顯示，Exosome^RNP在尾靜脈注射后主要分布于小鼠的肝臟部位，其分布半衰期為10.52 min，消除半衰期為154.5 min，且具備優(yōu)良的生物相容性及低免疫原性。

圖1. 肝靶向Cas9蛋白外泌體的制備及其在肝疾病基因治療中的應(yīng)用（圖片來源：Sci. Adv.）

多種肝臟疾病的基因治療

疾病模型1：急性肝損傷，靶基因：p53上調(diào)的凋亡調(diào)節(jié)劑（PUMA）。在對乙酰氨基酚誘導的小鼠急性肝損傷模型中，間隔48 h的兩次給藥后，Exosome^RNP實現(xiàn)了小鼠肝部位PUMA基因約26.1%的敲除效率，并且顯著抑制了對乙酰氨基酚導致的血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）水平的升高。蘇木精-伊紅（H&E）染色結(jié)果顯示Exosome^RNP治療組小鼠的肝部位小葉中心細胞壞死和充血狀況得到顯著緩解，TUNEL細胞凋亡檢測表明Exosome^RNP顯著降低了小鼠肝部位細胞凋亡的比例，進而提高了小鼠72 h的存活率。

疾病模型2：慢性肝纖維化，靶基因：細胞周期蛋白E1（CcnE1）。CcnE1蛋白是周期蛋白依賴性激酶家族的一員，它能夠促進肝星狀細胞的增殖，在肝纖維化形成過程中發(fā)揮著重要的作用，抑制CcnE1蛋白的表達能夠抵抗肝臟的纖維化。在四氯化碳誘導的小鼠實質(zhì)性肝纖維化模型中，每周兩次共計八次給藥后，Exosome^RNP實現(xiàn)了小鼠肝部位CcnE1基因約9.7%的敲除效率，并顯著抑制了四氯化碳誘導的CcnE1蛋白及α-平滑肌肌動蛋白的高表達，阻止了肝纖維化的發(fā)生。天狼星紅和馬森染色（評價肝纖維化水平）結(jié)果顯示，Exosome^RNP治療組小鼠肝部位天狼星紅和馬森陽性區(qū)域顯著小于其他對照組，表明Exosome^RNP能夠有效抑制四氯化碳導致的慢性肝纖維化進程（圖2）。

疾病模型3：原位肝癌，靶基因：賴氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶5（KAT5）。賴氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶5在肝癌的發(fā)生與進展中發(fā)揮著重要的作用，敲除編碼賴氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶5的基因能夠抑制腫瘤的生長。在原位肝癌（Huh-7細胞）小鼠模型中，每周兩次共計八次給藥后，Exosome^RNP實現(xiàn)了小鼠原位肝腫瘤KAT5基因約21.3%的基因敲除效率，并降低了賴氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶5的表達水平，抑制了腫瘤的生長，進而顯著提高了小鼠的存活率，展現(xiàn)了Exosome^RNP在原位肝癌治療中的極大潛力。

圖2. Exosome^RNP介導的基因編輯抑制四氯化碳誘導的肝纖維化（圖片來源：Sci. Adv.）