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納米孔道師法自然，模擬細(xì)胞膜表面蛋白質(zhì)通道，其限域空間提供了最逼近實(shí)際生命體系中分子反應(yīng)行為的場所，可實(shí)現(xiàn)在極短的時域內(nèi)捕獲單個分子瞬態(tài)變化，從而探索基礎(chǔ)生物化學(xué)領(lǐng)域新現(xiàn)象、新規(guī)律和新知識提供可靠的單分子電化學(xué)測量方法。早在上世紀(jì)90年代，納米孔道最初作為一種生物傳感器開發(fā)應(yīng)用于超靈敏核酸測序和無標(biāo)記生物小分子的單分子傳感測量。經(jīng)過近30年的發(fā)展，納米孔道單分子電化學(xué)分析技術(shù)已應(yīng)用于DNA測序等。在DNA測序以外，近年來其在蛋白質(zhì)檢測與測序、生物化學(xué)反應(yīng)動態(tài)測量研究等方面顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢。

南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院龍億濤教授、應(yīng)佚倫團(tuán)隊(duì)長期致力于納米孔道電化學(xué)傳感機(jī)制與應(yīng)用研究，積累了十多年的實(shí)驗(yàn)實(shí)踐、理論認(rèn)知以及儀器開發(fā)經(jīng)驗(yàn)。近日，龍億濤教授、應(yīng)佚倫教授團(tuán)隊(duì)與國際頂尖納米孔(道)研究團(tuán)隊(duì)梳理回顧了近年來納米孔道電化學(xué)技術(shù)在蛋白質(zhì)分析和測序、單分子共價化學(xué)、液體活檢臨床應(yīng)用以及仿生納米孔道系統(tǒng)構(gòu)建與應(yīng)用等方面的發(fā)展現(xiàn)狀和主要挑戰(zhàn)，深入探討了納米孔道電化學(xué)“限域空間效應(yīng)“為單分子測量技術(shù)帶來的新機(jī)遇、新挑戰(zhàn)和新應(yīng)用。 

圖1：極具潛力納米孔道電化學(xué)單分子研究領(lǐng)域。

生物/化學(xué)功能化修飾賦予納米孔道理想的幾何尺寸和豐富的界面性質(zhì)，有助于提高傳感靈敏度和選擇性，允許納米孔道從本體溶液中高效地捕獲、識別和傳輸各種分子和離子。在典型的納米孔道測量中，單個分析物分子在外加電場作用下進(jìn)入納米孔道限域空間，擾動離子流動和分布，產(chǎn)生與分析物尺寸、電性、序列等相關(guān)的時序電流響應(yīng)變化。通過解析單分子電信號的電流幅值與波動程度、持續(xù)時間和事件頻率等特征差異，納米孔道在單分子水平上實(shí)現(xiàn)了包括DNA、RNA、多肽、蛋白質(zhì)、小分子代謝物及其復(fù)合物在內(nèi)的多種生物分子的隨機(jī)傳感測量和表征。

從2004年使用α-溶血素納米孔道檢測多肽開始，納米孔道技術(shù)在蛋白組學(xué)研究方面取得了許多重要進(jìn)展，包括多肽長度與體積表征、多肽/蛋白質(zhì)翻譯后修飾識別與構(gòu)象變化研究、蛋白質(zhì)相互作用分析以及酶活性測定。最新研究利用DNA聚合酶或解旋酶控制DNA-多肽復(fù)合物單體順次過孔速度，實(shí)現(xiàn)了不超過17個氨基酸長度多肽片段的序列測定，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了納米孔道蛋白質(zhì)測序的可行性。

圖2：(a) 單分子蛋白質(zhì)識別原理示意圖；(b) 基于ClpXP的蛋白質(zhì)解折疊；(c) 實(shí)時監(jiān)測單分子多肽瞬態(tài)構(gòu)象轉(zhuǎn)換。

蛋白質(zhì)生物納米孔道具有天然的限域結(jié)構(gòu)，可以作為優(yōu)秀的納米級反應(yīng)器，其限域環(huán)境與聚合物單分子反應(yīng)動力學(xué)密切相關(guān)，通過改變納米反應(yīng)器內(nèi)空間分離的活性基團(tuán)的排布可實(shí)現(xiàn)化學(xué)反應(yīng)選擇性的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，聚合物骨架中的二硫化物與納米孔道內(nèi)半胱氨酸的反應(yīng)強(qiáng)烈依賴于它們在納米孔道內(nèi)的相對位置。基于限域化學(xué)選擇性，在納米孔道內(nèi)構(gòu)建半胱氨酸軌道，通過連續(xù)的硫醇-二硫化物交換反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了DNA 單分子機(jī)器亞納米級步長的定向行走。

圖3：納米孔道限域單分子聚合物化學(xué)反應(yīng)研究 

生物/固體納米孔道、蛋白質(zhì)工程以及DNA納米技術(shù)的發(fā)展，為建造納米孔道仿生系統(tǒng)解決生物學(xué)難題提供了借鑒。經(jīng)典范例包括：在固體納米孔道內(nèi)修飾固有無序FG核孔蛋白(FG-Nups)成功構(gòu)建了仿生核孔復(fù)合物，探究了并證實(shí)了FG-Nups網(wǎng)絡(luò)及其疏水殘基對核孔復(fù)合物選擇性的重要作用；利用可編程的DNA origami作為支架錨定FG-Nups得到仿生核孔復(fù)合物，借助顯微成像技術(shù)研究了受限FG-Nups的空間排列，該平臺能夠用于進(jìn)一步探索不同類型FG-Nups形成的復(fù)雜度更高的網(wǎng)絡(luò)。

圖4：基于固體納米孔道與DNA origami的仿生核孔復(fù)合物構(gòu)建

近幾年，納米孔道技術(shù)在臨床檢測應(yīng)用方面取得了一系列進(jìn)展。研究人員嘗試將納米孔道傳感器集成到微流控系統(tǒng)中，開發(fā)智能分析方法和設(shè)備用于臨床樣品制備和分析物濃縮；設(shè)計探針分子與體液樣本中的目標(biāo)分析物特異性結(jié)合形成復(fù)合物，光電同步測量它們及其復(fù)合物的信號響應(yīng)差異；在生物納米孔道（如OmpG、t-FhuA孔道）孔口處連接一個抗體或蛋白受體誘捕目標(biāo)蛋白研究兩者結(jié)合/解離動力學(xué)，或者在孔道內(nèi)裝配一個底物結(jié)合蛋白檢測體液樣本中葡萄糖、維生素B1等代謝物小分子的濃度。此外，通過選擇性降解背景分子增強(qiáng)檢測特異性同時規(guī)避對納米孔道結(jié)構(gòu)功能的負(fù)面影響，最近報道了一種納米孔道數(shù)字計數(shù)方法，使用酶降解寡聚核苷酸探針與mRNA生物標(biāo)志物結(jié)合后的背景分子，無需純化和PCR擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)了臨床樣本中SARS-CoV-2冠狀病毒的準(zhǔn)確測量。

圖5：納米孔道傳感技術(shù)的生物樣本檢測流程

未來納米孔道單分子電化學(xué)分析技術(shù)的發(fā)展仍面臨諸多機(jī)遇與挑戰(zhàn)，本文探討和展望了孔道構(gòu)建、蛋白質(zhì)分析、單分子化學(xué)、信息存儲以及生物醫(yī)藥與臨床診療等方面的應(yīng)用，主要包括：生物、固體納米孔道的天然/非天然基團(tuán)可控修飾；蛋白質(zhì)納米孔道從頭設(shè)計和DNA origami納米孔道定制合成；構(gòu)建合適的納米孔道限域環(huán)境精確控制單分子化學(xué)反應(yīng)進(jìn)程有望用于高效合成；開發(fā)大規(guī)模集成化便攜式納米孔道儀器系統(tǒng)提高傳感精度、時間分辨率和檢測效率，可實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確快速揭示單分子聚合物(如蛋白質(zhì)、多糖和脂類)的確切組成和單體序列，從而發(fā)展用于個體精準(zhǔn)診療納米孔道單分子體外診斷技術(shù)。 

相關(guān)內(nèi)容以“Nanopore-based technologies beyond DNA sequencing”為題發(fā)表在Nature Nanotechnology (2022, DOI: 10.1038/s41565-022-01193-2)上，應(yīng)佚倫教授、胡正利副研究員為論文共同第一作者，南京大學(xué)為第一完成和通訊聯(lián)絡(luò)單位，牛津大學(xué)Hagan Bayley教授、代爾夫特理工大學(xué)Cees Dekker教授、以色列理工學(xué)院Amit Meller教授、格羅寧根大學(xué)Giovanni Maglia教授和南京大學(xué)龍億濤教授為共同通訊作者，該工作得到了國家自然科學(xué)基金(22027806, 21922405, 22106066)等支持。

文章連接為：

https://www.nature.com/articles/s41565-022-01193-2