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傳統的SPPS所采用的固定相（聚苯乙烯基質交聯1-2%二乙烯苯）因其在水溶液中極低的溶脹而不能直接使用于ASPPS。與此不同，ChemMatrix （100% 聚乙二醇）樹脂符合這一技術要求。聚乙二醇具有雙親性質，使其在諸如水、四氫呋喃、甲醇、二氯甲烷和二甲基甲酰胺等多種溶劑中展現出較好的溶脹效果。另外一種可以用于ASPPS的樹脂為PEGA樹脂。與純聚乙二醇為骨架的ChemMatrix樹脂不同，PEGA樹脂的骨架為聚乙二醇與聚丙烯酰胺嵌段共聚物。在溶脹方面，PEGA與ChemMatrix表現相當。除此之外，聚乙二醇與氨甲基聚苯乙烯側鏈共聚產生的接枝共聚物（PEG-PS）和TentaGel樹脂（聚乙二醇與低交聯羥乙基聚苯乙烯）也可以作為ASPPS的固定相。ASPPS樹脂的功能性手臂與傳統的SPPS并無太大差異，比如Rink amide, HMPB (hydroxymethyl-3-methoxyphenoxy-butyric acid)和HMBA (hydroxymethyl-benzoic acid)等。

使用于ASPPS的縮合試劑必須滿足：1） 在水溶液中具有相當的溶解度；2）在水溶液中具有相當的穩定性；3）羧基活化后的穩定性；4）羧基活化，以及酰胺鍵形成的較快反應速率；5）低消旋副反應等條件。符合以上要求并且經常在ASPPS中廣泛應用的縮合試劑，最常用的為EDC-HCl（也被稱做WSCD），已在多篇文獻中報道。EDC經常與HONB，Oxyma, sulfo-HOSu等縮合添加物聯用。可應用在ASPPS中的其它縮合試劑還包括DMTMM, TNTU, COMU （圖1）。

圖1. 常用ASPPS縮合試劑與添加劑 （圖片來源：Green Chem.）

有研究發現，HATU和PyBOP在水溶液中的縮合反應表現劣于COMU。后者與2,6-二甲基哌啶聯用，在降低氨基酸消旋副反應上有良好表現，并在ASPPS法合成低極性多肽方面實現了應用。TCFH (N,N,N’,N’-tetramethylchloroformamidinium hexafluorophosphate) 與三甲基哌啶介導的，在20 % PolarClean?（methyl 5-(dimethylamino)-2-methyl-5-oxopentanoate）水溶液中，以TentaGel S作為樹脂的ASPPS的表現比COMU 更優秀 （圖2）。TNTU作為縮合試劑的作用在一項ASPPS對比實驗中不如EDC，即便在HONB的存在下也表現不佳，其主因在于TNTU的水解。與此不同的是，DMTMM可以勝任50% 的乙醇水溶液中的縮合反應，但在純水中的縮合效率低下。

圖2. TCFH和PolarClean化學結構

實際上, N^α-Fmoc保護的氨基酸在很多綠色溶劑中的低溶解度限制了這些綠色溶劑的使用。對于水來說，這個問題更加突出。Fmoc-Xaa-OH在水中通常具備非常低的溶解度，極大阻礙了ASPPS。針對氨基酸溶解度的問題，一些新型N^α-保護基團應運而生，并在ASPPS中驗證了其價值。這些保護基包括Pms (2-[phenyl(methyl)sulfonio]ethyloxycarbonyl tetrafluoroborate, 2-[苯基(甲基)磺酰基]乙氧羰基四氟硼酸鹽), Esc (ethanesulfonylethoxycarbonyl, 乙磺酰基乙氧基羰基), Sps (2-(4-sulfophenylsulfonyl)ethoxycarbonyl, 2-(4-磺基苯磺酰基)乙氧羰基)，它們的化學結構如圖3A所示。不難發現，這些Fmoc的替代物在化學結構上與Fmoc存在明顯相似點，即2-X-乙氧羰基，其中X為強拉電子基團。與Fmoc一樣，這些N^α-保護基都可以與堿發生E1cB消除反應，以及隨之而來的脫羧反應，實現N^α的脫保護（圖3B）。這些ASPPS的N^α-保護基團，其X部分都含有親水結構，而不同于Fmoc里高度疏水的芴Fluorenyl 。這個特征可以顯著增加N^α-保護氨基酸在水中的溶解度，從而滿足ASPPS對于氨基酸水溶液的濃度要求。這些新型的N^α-保護基氨基酸實現了Metenkephalin和Leu-enkephalin的水基固相合成。研究人員在這些項目中使用了PEG-PS樹脂，EDC, DMTMM或者TNTU 縮合試劑，以及HONB和sulfo-HOSu縮合添加劑。Pms-Xaa-OH 被EDC/HONB縮合，而Esc-或Sps-Xaa-OH的縮合反應是在DIPEA的存在下進行的。在所有這些ASPPS中，固相洗滌溶液為純水或0.2%的Triton X（曲拉通100）水溶液，后者可以增加樹脂的溶脹度。盡管這些新型N^α-保護基在ASPPS中得到了一定程度的應用，但也存在與之俱來的缺陷，比如Pms的穩定性問題，以及Esc在水溶液中脫保護不徹底的現象。

圖3. N^α-保護基團 Fmoc類似物，以及堿性環境脫保護反應。（圖片來源：Green Chem.）

一種Fmoc的類似物，被稱作Smoc（2,7-disulfo-9-fluorenylmethoxycarbonyl，2,7-二磺基-9-芴基甲氧羰基）的N^α-保護基也在ASPPS中得到了使用。Smoc是Fmoc上2,7-位的2個H被磺酸基取代后衍生得到的（圖4），因為磺酸基的存在，其堿敏感性和水溶液溶解度都得到了增強。其脫保護的方式與機理也與Fmoc相同。

圖4. Smoc保護基團

在一系列Smoc-Xaa-OH參與的ASPPS反應中，酰基載體蛋白 (ACP) 65–74 , oxytocin, 和vasopressin等多肽的合成得到了令人滿意的收率（大約72%）。研究者使用EDC作為縮合試劑，在測試的各種縮合添加劑中，oxyma的表現最佳，其次為HOPO。使用了HMPB-ChemMatrix和H-Rink amide-ChemMatrix樹脂。所有固相洗滌均通過水實現。Smoc的脫保護由1 M NaOH 水溶液（Rink amide-ChemMatrix樹脂）或5-10% 哌嗪水溶液完成。

盡管傳統的Fmoc 和Boc-氨基酸在水中的低溶解度阻礙了它們在ASPPS中的使用，但研究者還是嘗試了這些傳統SPPS原料在ASPPS方案中的利用可能。他們使用氧化鋯珠將這些氨基酸粉末研磨成納米顆粒，得到了 250-500 納米范圍的Fmoc-氨基酸納米顆粒和500-750 納米范圍的Boc-氨基酸，并將這些研磨后的納米顆粒的水懸浮液投入固定相進行ASPPS合成（圖5）。通過這種手段，研究者以Fmoc-ASPPS方式在TentaGel樹脂上合成了一個五肽。固相洗滌液為純水，Fmoc脫保護試劑為0.1 M NaOH的90% 乙醇水溶液，縮合試劑組為EDC/HONB/DIPEA，最終得到了61%的五肽收率。在另一項相關實驗中，研究者使用Boc-氨基酸實現了89%收率的Leu-Enkephalin 的ASPPS合成。縮合試劑為DMTMM/NMM, 并使用含有少量TFA的4 M HCl溶液脫Boc。該實驗者還發現，這種納米顆粒技術可以結合微波ASPPS完成長肽的合成。他們采取DMTMM/NMM縮合試劑，并且發現該合成方法可以明顯降低氨基酸消旋副反應。例如Cys(Acm)的消旋從傳統有機溶劑介導的SPPS的10.5%降低到了0.5%；而His(Trt)的消旋率從13.8%減少到了3.3%。

圖5. Fmoc/Boc-氨基酸納米顆粒水懸浮液介導的ASPPS （圖片來源：Green Chem.）。

另外一組研究者通過2% (w/w) TPGS-750-M–H₂O膠束介質實現了Z-氨基酸短肽（二至三肽）ASPPS合成, 其示意圖見圖6。

圖6. TPGS-750-M–H₂O水性膠束中的多肽合成（圖片來源：Green Chem.）

盡管三官能團氨基酸的側鏈在傳統SPPS中通常是被保護的，但這些氨基酸中除了Cys的巰基，Lys的氨基和Asp/Glu的羧基之外，其余官能團可以在不被保護的情況下參與多肽合成，比如Ser/Thr的羥基，His的咪唑基，Tyr的酚羥基，Asn/Gln的酰胺基，Trp的吲哚基和Arg的胍基。這些非極性保護基團的去除，可以增加主體氨基酸自身的親水性，并提高它們在水溶液中的溶解度，無論從增加原子經濟性，降低PMI，還是實現綠色ASPPS的角度來看，擺脫不必要氨基酸側鏈保護基都是有益的。有研究者成功使用側鏈不保護的Pms-Tyr-OH和Esc-Tyr-OH作為原料合成了Met-Enkephalin和Leu-Enkephlin。

本文作者在最后總結了文獻報道的ASPPS實例（表1）。

表1. 文獻報道ASPPS實例總覽（圖片來源：Green Chem.）

在綠色化學方興未艾的當今，傳統的固相多肽合成面臨過度使用有害有機溶劑的瓶頸，也因此受到環境與監管部門的挑戰。在這種大環境下，開發多肽合成的綠色溶劑成為整個行業的關注點。本文重點介紹了水作為溶劑介導多肽固相合成的技術，從樹脂、縮合試劑、N-保護基，以及側鏈保護基的角度，討論了該技術和工藝的可應用性，并列舉了水基多肽固相合成的成功案例。

盡管相較于綠色有機溶劑引發的多肽生產變革，水基固相多肽合成的工業應用有待增強，但它代表了綠色多肽合成的一種發展方向。在樹脂基質，縮合試劑，N^α-保護基的共同進化下，ASPPS有望取得更大的應用價值。

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