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圖1.哌嗪衍生的LNP的合成與表征（圖片來源：Nat. Commun.）

肝臟作為人體最大的代謝器官兼具儲存糖原及造血功能，其中肝血竇（相鄰肝板之間的腔隙，是一種特殊的毛細血管）包含不連續(xù)的脈管系統(tǒng)以及緩慢的血流，有利于肝細胞與血流之間進行物質(zhì)交換，增加了納米顆粒外滲和與肝細胞的相互作用，因此將RNA遞送至非肝細胞成為亟待解決的問題。目前研究人員側(cè)重于以下幾個方面：1）對動物進行預(yù)處理，使肝細胞提前過載，從而改變LNP嗜性。然而，目前尚不清楚這種多步驟策略是否具有臨床相關(guān)性；2）LNP偶聯(lián)活性靶向配體。例如，DLin-MC3-DMA（一種經(jīng)FDA批準用于肝細胞siRNA遞送的可電離lipid）結(jié)合抗體可重新靶向免疫細胞。這種方法的潛在限制是——含有RNA藥物的主動靶向納米顆粒在臨床試驗中可引起不良事件。3）單個識別納米顆粒體內(nèi)代謝途徑，實現(xiàn)內(nèi)源性靶向。此方法需要高通量體內(nèi)篩選，不適用于大型lipid庫。因此目前大部分lipid高通量篩選處于在體外細胞水平。本文中，作者通過DNA序列“條形碼”，篩選了65種不同的LNP，每個LNP均用獨特的“條形碼”標記。體內(nèi)注射后，對從不同組織中提取的條碼進行測序，通過檢索14種細胞類型的DNA“條形碼”，便可知其體內(nèi)分布。

作者首先設(shè)計了由哌嗪核心和兩個叔胺組成的可電離脂質(zhì)體頭部，其可與疏水碳鏈相連（Pi-Lipids）（圖1a）。其中以哌嗪為核心，添加了從C10到C12的飽和烴鏈（之前研究表明C10到C12的烷烴長度有助于增強細胞膜穿透；ID:10-12）。此外，亞油酸鏈也被證實可增強LNP的胞內(nèi)遞送，因此作者也將其納入體系（ID:18-2Z）（圖 1b，c）。這八種新的基于哌嗪的可電離脂質(zhì)體具體合成步驟如下：1,4-雙（3-氨基丙基）哌嗪與Boc保護的β-丙氨酸或γ-氨基丁酸通過酰胺偶聯(lián)反應(yīng)12小時，產(chǎn)生哌嗪中間體，產(chǎn)率為50%。隨后脫除Boc保護基，然后與不同疏水醛進行一鍋法還原胺化反應(yīng)，得到最終的哌嗪基脂質(zhì)（PPZ），產(chǎn)率為32%至59%。作者改變了碳鏈鍵的長度并在兩個骨架中合成了lipid，PPZ-A含兩個碳，PPZ-B含三個碳。脂質(zhì)結(jié)構(gòu)通過核磁共振和高分辨率質(zhì)譜分析確證。

圖2. 量化分析65種mRNA LNP體內(nèi)遞送以及結(jié)構(gòu)分析（圖片來源：Nat. Commun.）

作者進一步研究了Pi-Lipids是否可制備為單分散LNP（Pi-LNP）。采用了（i）可電離陽離子lipid；（ii）兩種具有不同碳鏈長度的PEG-lipid（C₁₄PEG_2K和C₁₈PEG_2K）；（iii）兩種膽固醇（膽固醇、20α-羥基膽固醇）；（iv）磷酸乙醇胺（DOPE）。作者將Cre mRNA和DNA“條形碼”以10比1的質(zhì)量比進行混合。每個LNP都經(jīng)過配制以攜帶其獨特的DNA“條形碼”，所有DNA“條形碼”均為91nt長的單鏈DNA序列。用硫代磷酸酯修飾5'和3'末端以減少外切核酸酶降解，采用通用正向和反向引物區(qū)域以確保每個序列的相等擴增，包含7個隨機核苷酸以監(jiān)測PCR偏差。

在對65個Pi-LNP進行表征后，作者將其靜脈注射入Ai14小鼠中（圖 2a)。Ai14小鼠在CAG啟動子下游有一個Lox-Stop-Lox-tdTomato構(gòu)建體。因此，如果Cre mRNA被遞送到靶細胞中并隨后翻譯成Cre蛋白，則細胞變?yōu)閠dTomato+（圖 2a）。通過熒光激活細胞分選分離tdTomato+細胞并對細胞進行測序，在tdTomato+細胞內(nèi)分離與特定LNP相關(guān)的DNA 條形碼。作者共量化了14個不同細胞群的tdTomato+細胞的百分比（圖 2b）。在枯否細胞中觀察到40%的tdTomato+細胞，在脾巨噬細胞中為10%，在脾樹突細胞中為16%。在肝內(nèi)皮細胞和樹突細胞tdTomato+%<5%，肺和腎沒有觀察到tdTomato+細胞。之后，作者使用下一代DNA測序研究了65個LNP。然后，使用大型數(shù)據(jù)集對所有細胞類型進行全面結(jié)構(gòu)分析。首先，分析了基于不同Pi-Lipid結(jié)構(gòu)的LNP的平均歸一化遞送，發(fā)現(xiàn)含有PPZ-A10的Pi-LNP 表現(xiàn)出最高的遞送，其次是PPZA11（圖 2d）。作者假設(shè)在Pi-LNP之間觀察到的標準化傳遞的差異可能是由于封裝效率或LNP直徑差造成的。為了驗證這一假設(shè)，配制了八個LNP，僅改變可電離脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，同時保持相同的摩爾比和化合物組成，并測量每個LNP的直徑和封裝效率（圖 2e）。作者觀察到分別用PPZ-A10到PPZ-A18-2Z配制的Pi-LNPs的封裝效率從66%增加到88%，這表明封裝效率隨著碳鏈越長而增加。然而，具有較長碳鏈的Pi-LNP也顯示出150到300 nm大直徑，不利于LNP的體內(nèi)遞送。用PPZ-A和PPZ-B脂質(zhì)配制的Pi-LNP之間的封裝效率相當，但含有PPZ-B脂質(zhì)的Pi-LNP 比PPZ-A的尺寸大，因此體內(nèi)遞送量降低（圖 2d）。

本文中，作者通過設(shè)計、合成和表征128種新型Pi-LNP，并將核酸遞送到體內(nèi)的非肝細胞。其中LNP-A10，以低至0.3mg/kg的劑量優(yōu)先向肝臟和脾臟免疫細胞遞送mRNA。作者將PPZ脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)與包含哌嗪基序的商業(yè)脂質(zhì)（C12-20039）進行比較，其添加了酰胺鍵并去除了羥基。羥基會產(chǎn)生立體異構(gòu)體，使純化變得困難。相比之下，PPZ脂質(zhì)是手性純的，這使得它們更容易純化。作者發(fā)現(xiàn)與之前報道的C12-20039相比，Pi-LNP對脾巨噬細胞和樹突狀細胞的遞送增加。

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