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肝纖維化是由病毒性乙型或丙型肝炎感染、自身免疫和膽道疾病、酒精性和非酒精性脂肪性肝炎等引起的慢性炎癥，是肝臟疾病發(fā)病率和死亡率的主要原因。纖維化的特點是細胞外基質(zhì)(ECM)成分在肝臟中的逐漸積累，并且很有可能發(fā)展為肝硬化、肝細胞癌、肝功能衰竭或死亡，使其成為巨大的經(jīng)濟和社會負擔。此外，晚期肝纖維化通常被認為是不可逆的，終末期肝硬化的唯一治愈方法是移植，這凸顯了早期發(fā)現(xiàn)的必要性?；顧z是了解肝纖維化發(fā)作及其疾病活動性，和對肝纖維化嚴重程度進行病理分期的臨床黃金準則；然而，活檢是侵入性的，存在取樣誤差和并發(fā)癥風險。缺乏檢測和量化肝纖維化的非侵入性方法極大地阻礙了肝纖維化的診斷以及新療法的開發(fā)。

在肝纖維化過程中，慢性肝損傷導致重塑ECM的肝星狀細胞活化和增殖。賴氨酰氧化酶(LOX)酶家族的上調(diào)催化ECM（主要是膠原蛋白）上的賴氨酸ε-氨基氧化形成醛賴氨酸(Lys^Ald)，然后與其他蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)以穩(wěn)定纖維化ECM。作者在前期工作中已經(jīng)證明Lys^Ald是纖維化發(fā)生的生物標志物，并且用肼官能團修飾的基于釓(Gd)的磁共振探針可以在體內(nèi)與Lys^Ald共價結(jié)合，以量化纖維化的發(fā)展。但是，人們對基于Gd的造影劑的長期安全性感到擔憂。釓與腎源性系統(tǒng)性纖維化有關(guān)，這是一種潛在的致命疾病，伴有硬皮病樣皮膚損傷，發(fā)生在腎功能降低的患者身上。

錳絡(luò)合物是作為MRI造影劑的Gd³⁺絡(luò)合物的有前途的替代品。而且，錳也是人體必需的元素，少量殘留的錳可通過內(nèi)源性機制加工清除。此外，Mn具有正電子發(fā)射斷層掃描(PET)同位素⁵²Mn，半衰期為5.6天，因此可以使用PET-MRI在幾天內(nèi)評估全身藥代動力學。然而，由于缺乏配體場穩(wěn)定能，Mn(II)配合物通常很不穩(wěn)定，迄今為止，僅有有限的具有高熱力學和動力學穩(wěn)定性的Mn(II)配合物的報道。這是肝臟成像病理學的一個特殊挑戰(zhàn)，因為游離Mn²⁺會被正常肝臟中的肝細胞大量吸收，從而導致高背景信號。因此，響應(yīng)性和靶向性錳造影劑的設(shè)計更具挑戰(zhàn)性。

作者認為用于肝纖維化成像的錳基MR探針必須滿足幾個要求：(1)不與Lys^Ald結(jié)合時的弛豫低，以盡量減少背景信號；(2)與Lys^Ald結(jié)合時具有高弛豫以增加纖維發(fā)生部位的信號；(3)高動力學惰性，防止游離Mn²⁺釋放造成高肝臟背景信號；(4)完整配合物的最小肝膽消除，以最小化肝臟背景；(5)一種氧化還原穩(wěn)定的Mn²⁺配合物，因為Mn³⁺可以氧化肼。基于這些設(shè)計要求，作者合理設(shè)計并合成了新型修飾肼官能團的錳基MRI探針，用于檢測肝纖維化（圖1）。

圖 1. 用于靶向肝纖維化過程中Lys^Ald的可逆雙結(jié)合錳基MRI探針設(shè)計示意圖（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

首先，由于cis-Mn-1,4-DO2A已經(jīng)被證明具有抗氧化穩(wěn)定性以及高熱力學穩(wěn)定性和動力學惰性，因此，作者設(shè)計了基于cis-Mn-1,4-DO2A結(jié)構(gòu)的雙結(jié)合錳基探針（圖 2）。這種雙結(jié)合位點的設(shè)計方法能夠有效提高Lys^Ald的反應(yīng)速率，并在結(jié)合時提供較大的弛豫開啟，因為“雙鎖定”探針將減少蛋白質(zhì)結(jié)合的Mn復(fù)合物的內(nèi)部運動。因此，作者將兩個哌嗪-肼或酰肼部分引入cis-Mn-1,4-DO2A的骨架中以形成Mn(II)配合物Mn-2CHyd和Mn-2Hyd。此外，作者還合成了含有一個哌嗪-肼的對照探針Mn-1Chyd。與酰肼相比，哌嗪-肼單元對Lys^Ald具有更高的反應(yīng)性和親和力。接著，作者對探針的性能進行了表征。在循環(huán)伏安法實驗中，Mn-2CHyd在969 mV (E_pa) 處顯示出不可逆的Mn^II/Mn^III峰和在731 mV處的配體氧化峰，表明Mn²⁺在Mn-2CHyd中不易被氧化。然后，通過測量Zn²⁺存在下Mn²⁺配合物的縱向弛豫變化驗證了探針對Mn²⁺釋放的惰性。

圖 2. 錳基MRI探針的結(jié)構(gòu)及其性能表征（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

然后，作者通過高效液相色譜結(jié)合電感耦合等離子體質(zhì)譜(HPLC-ICP MS)比較了配合物與丁醛（一種Lys^Ald的小分子模型）的反應(yīng)性（圖3）。結(jié)果顯示，相應(yīng)腙絡(luò)合物的最快形成的是與Mn-2CHyd形成的絡(luò)合物，在pH 7.4下，轉(zhuǎn)化率和締合速率常數(shù)都比Mn-1CHyd高2倍。與形成雙腙產(chǎn)物的富電子烷基肼Mn-2CHyd相比，帶有Mn-2Hyd的缺電子酰基肼90 min后轉(zhuǎn)化率略低，并且沒有形成相同反應(yīng)條件下的雙腙產(chǎn)物。Mn-2Hyd的反應(yīng)性在更酸性的條件下(pH 6.5)顯著增加，這表明Mn-2Hyd具有作為pH敏感的Lys^Ald靶向探針的潛力。在所有反應(yīng)過程中，均未檢測到游離錳，進一步證明了配合物的穩(wěn)定性。

圖 3. 探針的響應(yīng)性能測試（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

接下來，作者驗證了Mn(II)配合物與含有牛血清白蛋白(BSA^Ald)的Lys^Ald的反應(yīng)，以評估蛋白質(zhì)結(jié)合的效果。結(jié)果顯示，在BSA中，所有Mn(II)配合物的弛豫度與PBS中的類似，表明存在可忽略不計的非特異性結(jié)合。然而，在BSA^Ald中的弛豫度顯著增加，Mn-2Hyd、Mn-1CHyd和Mn-2CHyd分別增加了42%、37%和103%。作者通過分離BSA^Ald結(jié)合的物質(zhì)進一步量化了結(jié)合產(chǎn)率和弛豫度。其中，Mn-2CHyd在不同濃度下顯示出最高的結(jié)合產(chǎn)率。相比之下，蛋白質(zhì)結(jié)合的Mn-1Chyd顯示出較低的弛豫度，從而證明了雙結(jié)合位點的設(shè)計方法在通過限制分子旋轉(zhuǎn)來提高弛豫方面的有效性。

由于Mn-1CHyd和Mn-2CHyd在BSA^Ald中顯示出比Mn-2Hyd更高的反應(yīng)性和弛豫性，作者進一步在體內(nèi)測試了這兩種復(fù)合物，并使用PET-MRI研究了它們在正常小鼠中的藥代動力學（圖4）。兩種探針在靜脈注射后從血液中快速消除，通過腎臟進入膀胱。然而，Mn-1CHyd在MRI和PET中均顯示出高度的肝臟信號增強，而隨著時間的推移，Mn-2CHyd的信號在健康肝臟中幾乎沒有增強。24 h后，與來自Mn-1CHyd的Mn-52相比，來自Mn-2CHyd的Mn-52在各個器官中的保留較低。這些研究表明，Mn-1CHyd不適合肝臟的MR成像，因為它的肝臟攝取會產(chǎn)生高的非特異性信號。

圖 4. 體內(nèi)藥代動力學實驗（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

接下來，作者測試了Mn-2CHyd是否可以檢測體內(nèi)肝纖維化（圖5）。首先，作者用CCl₄對小鼠灌胃12周構(gòu)建了肝纖維化模型。然后，在靜脈注射Mn-2CHyd或Gd-DOTA（陰性對照）后立即在小鼠中進行磁共振成像。相較于對照造影劑，在注射后45分鐘，Mn-2CHyd顯示出比在健康小鼠中顯著增強的肝臟MR信號以及更慢的肝臟清除率。這些數(shù)據(jù)表明，Mn-2CHyd對肝纖維化的體內(nèi)檢測具有高度靈敏性和特異性。

圖 5. 肝纖維化的體內(nèi)檢測（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

哈佛醫(yī)學院的Peter Caravan教授課題組合理設(shè)計了基于Mn²⁺的MR探針，其在正常小鼠肝臟中具有較低的信號，但和Lys^Ald結(jié)合后開啟4倍弛豫。探針檢測肝纖維化的能力在體內(nèi)得到證實，其中Mn-2CHyd在纖維化小鼠中顯示出比在健康小鼠中顯著增強的肝臟MR信號，并且可以檢測非特異性臨床造影劑Gd-DOTA無法檢測到的病理。Mn配合物也可以用⁵²Mn進行放射性標記，可以進行PET-MRI雙模態(tài)成像分析。該工作有助于進一步開發(fā)和應(yīng)用錳基MRI探針用于肝纖維化磁共振成像。