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熒光納米顯微成像技術由于非侵入性、特異性強、分辨率高（納米級）等特點，被廣泛用來觀察生物樣品的精細結構。化學特異性熒光探針和“開-關”型熒光探針則為該技術的核心。光激活染料和籠狀染料在光的誘導下就可以發生可逆的熒光“開-關”轉換，省去了特定的成像緩沖溶液以及高強度的紫外激發光，因而被廣泛應用于單分子成像顯微鏡當中，如光激活定位顯微鏡（PALM）和隨機光學重構顯微鏡（STORM）。羅丹明染料因具有性能可調、細胞膜通透性好、亮度高和光穩定性好的優點而備受青睞。然而，已報道得的羅丹明的“籠閉”策略是依賴于“鎖住”染料分子使其不發光。一種是在氮原子上引入“光不穩定的保護基團”，另外一種是將內酯環轉化為相應的環狀α-重氮酮。前者會限制分子的取代方式，造成化合物水溶性變差、潛在的光毒性的問題，而后者會面臨非熒光副產物的形成以及潛在有毒副產物等問題。因此，發展無“籠閉”基團、光激活效率高以及生物相容性好的熒光團用于熒光顯微鏡和納米顯微鏡具有重要意義。本文中，作者合成了一系列功能化的氧雜蒽酮化合物，在單光子或者雙光子激發下，分子會高效地轉化為相應的二氫吡喃環派若寧染料。PaX染料通過三步合成即可被簡易制備，該策略可擴展到碳和硅橋聯的氧雜蒽酮類似物，得到一系列跨越大部分可見光譜的光激活熒光標簽。其中，PaX衍生物硅-派若寧染料展現了良好的生物相容性和優異的光穩定性。最后，作者還成功地將PaX染料用于傳統光學顯微鏡和超分辨顯微鏡的細胞成像當中。

作者利用光化學反應去組裝或者“鎖住”熒光團而不是“解鎖”光不穩定的保護基團”的策略制備得到了新型籠狀的羅丹明染料（Figure 1a）。通過在氧雜蒽酮骨架上引入合適的分子內自由基捕獲基團，二芳基酮和自由基捕獲基團（苯乙烯）通過光觸發級聯途徑可以光組裝為9-烷氧派若寧熒光團（Figure 1b）。為了研究自由基受體的取代作用，作者進一步合成了一系列光激活硅-派若寧染料（Figure 1c）。其中，化合物1-6在400 nm處具有較強的吸收峰。在光激活下，化合物1-6在質子溶劑中（如100 mM, pH=7的磷酸鹽緩沖溶液）會經歷快速且完全的化學結構變化，表現為明亮的發射（Figure 1d）。經實驗測得，乙烯基取代的化合物1的光激活速率最慢，隨著烯烴取代基團的增加，化合物4的速率最高，這可能是因為α-甲基取代基對烯烴的誘導作用（Figure 1e）。此外，作者還對進一步修飾的PaX染料化合物9-12進行了光激活速率的測試，化合物11的速率較高（Figure 1f），并得到其在一系列生理環境pH值下的光激活速率（Figure 1g）。最后，作者還測試了化合物11的光學穩定性，性能要優于商用染料（Figure 1h）。

Figure 1.  PaX染料的設計合成及表征（圖片來源：Nat. Chem.）

接下來作者探究了上述化合物在生物成像中的應用（Figure 2）。通過在PaX₅₆₀分子上偶聯具有氨基反應活性的N-羥基丁二酰亞胺基團，可將其用于靶向色氨酸上的-NH₂基團，因此得到了PaX₂₆₀-NHS探針。并分別進行了STED和PALM超分辨成像。同時，在PaX₅₆₀分子上偶聯具有巰基反應活性的馬來酰亞胺基團，得到的PaX₄₈₀, PaX₅₂₅ 和PaX₊₅₆₀探針可用于靶向色氨酸中的-SH基團。對于固定細胞肌動蛋白的標記，在PaX₅₆₀分子上偶聯鬼筆環肽（phalloidin），制備的PaX₂₆₀-phalloidin探針可實現對細胞的STED和PALM超分辨成像。

Figure 2. 光激活染料用于光學成像（圖片來源：Nat. Chem.）

為了評估PaX染料用于活細胞成像的光激發機制，作者制備了分別帶有線粒體和溶酶體靶向基團的染料PaX₅₆₀-Mito和PaX₅₆₀-Lyso（Figure 3a和b）。數據表明，在較高和較低的pH值條件下，兩種染料都具有良好的細胞器靶向性和光激活特性。同時，作者還制備了Halo Tag特異性的氯烷烴衍生物（PaX₅₆₀-Halo）和SNAP特異性的O⁶ -芐基鳥嘌呤衍生物（PaX₅₆₀-SNAP），并得到了PaX₅₆₀-Halo 標記的U2OS細胞中波形蛋白的雙光子共聚焦圖像以及STED圖像（Figure 3c-f）。

此外，在405 nm激光的照射下，PaX₅₆₀-Halo 和AL-560探針可實現在單個激發/檢測通道下對U2OS細胞中的微管蛋白和波形蛋白的共聚焦多色成像（Figure 4a-e）。

Figure 3. 光激活PaX染料用于活細胞成像（圖片來源：Nat. Chem.）

Figure 4.  PaX染料用于雙通道成像（圖片來源：Nat. Chem.）

另外，作者將化合物21和22用于活細胞SMLM成像當中（Figure 5）。所得到的圖像均可顯示明顯的蛋白形貌，說明PaX染料可以進行有效的細胞標記和檢測。最后，作者還將偶聯抗體的化合物14成功用于對HeLa-Kyoto細胞的MINFLUX成像當中（Figure 6），平均標記精度可以達到3.7 nm。

Figure 5. 自標記PaX₅₆₀底物對活細胞的PALM成像（圖片來源：Nat. Chem.）

Figure 6.  PaX₅₆₀底物對細胞的MINFLUX成像（圖片來源：Nat. Chem.）