在自然界中,許多蛋白質(zhì)組裝成特定的寡聚結(jié)構(gòu),其中包含多個(gè)不同蛋白質(zhì)的精確數(shù)量和寡聚序列。這種組裝可以決定蛋白質(zhì)的生物學(xué)特性(例如,人IgM抗體包含五個(gè)蛋白質(zhì)亞基)、催化特性(例如,真核RNA聚合酶II包含十二個(gè)蛋白質(zhì)亞單位)、光物理特性(例如,藍(lán)藻光系統(tǒng)I包含十二個(gè)蛋白亞基)、和膜轉(zhuǎn)運(yùn)特性(例如,青鏈霉菌鉀通道包含四個(gè)蛋白質(zhì)亞單元)。為了模仿并可能超越這些特性,需要對(duì)不同的蛋白質(zhì)寡聚體進(jìn)行模塊化合成。盡管使用分子生物學(xué)技術(shù)(包括基因工程和突變蛋白質(zhì)的重組表達(dá))可以實(shí)現(xiàn)制備(Fig. 1A)。然而,通過重組表達(dá)制備許多蛋白質(zhì)具有挑戰(zhàn)性(例如,具有翻譯后修飾的蛋白質(zhì)、具有二硫鍵的蛋白質(zhì)、毒蛋白質(zhì)、或聚集的蛋白質(zhì)),這可能限制了通過這些方法可以寡聚的蛋白質(zhì)的范圍。此外,化學(xué)方法是另一種控制寡聚的強(qiáng)大方法,如在基于特定位點(diǎn)進(jìn)行非天然氨基酸的融合表達(dá)和附著在化學(xué)支架上進(jìn)行組裝(Fig. 1B)。然而,前者如果沒有廣泛的化學(xué)設(shè)計(jì)、蛋白質(zhì)氨基酸序列的修飾和/或重組蛋白表達(dá),獲得大于二聚體或三聚體的單分散和序列編碼低聚物是一項(xiàng)挑戰(zhàn)。而后者必須改變DNA設(shè)計(jì),以合成含有不同數(shù)量或寡聚序列的蛋白質(zhì)寡聚體,這些限制大大阻礙了蛋白質(zhì)寡聚體的構(gòu)建和后續(xù)研究。
為了解決上述限制,作者提出了一組特定的DNA鏈可以用作模塊化支架,將蛋白質(zhì)組織成具有精確化學(xué)計(jì)量和寡聚序列的寡聚體(Fig. 1C)。這種DNA設(shè)計(jì)將使不同的蛋白質(zhì)精確地組織成一系列單分散、序列編碼的低聚物(Fig. 1Ci)。
Fig. 1: 蛋白質(zhì)低聚技術(shù)及其局限性 (圖片來源:Chem)
為了驗(yàn)證上述想法,作者選擇三種通常用作檢查點(diǎn)抑制劑的市售IgG抗體(即抗小鼠PD-1[A]、抗小鼠TIGIT[B]和抗小鼠CTLA-4[C]),使用模塊化DNA支架進(jìn)行蛋白質(zhì)的序列編碼寡聚。為了將單個(gè)DNA鏈安裝到A、B或C上,將每個(gè)抗體與2當(dāng)量含有N-羥基琥珀酰亞胺活化酯和疊氮化物(NHS–PEG12–N3)的低聚(乙二醇)分子反應(yīng)45分鐘(Fig. 2A)。在通過尺寸排阻色譜(SEC)純化后,每個(gè)抗體表面上的疊氮化物與5當(dāng)量含有二苯并環(huán)辛炔(DBCO)和熒光團(tuán)的DNA鏈和兩個(gè)不同的20堿基核酸序列進(jìn)行疊氮化合物-炔環(huán)加成(SPAAC)反應(yīng)。16小時(shí)后,約25%-30%的抗體被一條DNA鏈修飾。接下來,使用SEC從反應(yīng)混合物中去除未反應(yīng)的DNA。使用陰離子交換色譜法從未反應(yīng)的抗體和用多條DNA鏈官能化的抗體中分離出用單條DNA鏈功能化的抗體(Fig. 2A)。之后,制備了三種不同的蛋白質(zhì)DNA綴合物(即S2–A–Cy3–S3、S4–B–Cy5–S5和S6–C–FITC–S1),并通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE,F(xiàn)ig. 2B)和SEC確認(rèn)其含有單一DNA功能化。
Fig. 2: 單鏈DNA的抗體功能化 (圖片來源:Chem)
通過將純化的蛋白質(zhì)DNA綴合物(Fig. 3A和3E:lane 1-3)與模板DNA鏈混合來合成蛋白質(zhì)低聚物。等量的B-DNA綴合物、C-DNA綴合物、S50-60模板鏈、S50-S60模板鏈,混合S10-S20模板鏈以合成具有寡聚序列S4-B-C-S20的蛋白質(zhì)二聚體(Fig. 3B),組裝產(chǎn)率為68%。由于不存在與S4或S20 DNA序列互補(bǔ)的DNA序列,因此在組裝混合物中未觀察到含有多于兩個(gè)抗體的低聚物。使用SEC純化從組裝混合物中的未反應(yīng)單體和模板鏈中分離蛋白質(zhì)二聚體,并用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行表征(Fig. 3E: lane 4)。瓊脂糖凝膠顯示二聚體的單一條帶,僅具有預(yù)期的Cy5和FITC熒光,電泳遷移率低于單獨(dú)的抗體-DNA偶聯(lián)物。結(jié)果表明,成功合成了具有寡聚序列S4-B-C-S20的單分散和序列編碼的蛋白質(zhì)二聚體。
Fig. 3: 利用DNA-DNA相互作用將抗體寡聚成編碼序列 (圖片來源:Chem)
接下來,作者將等量的A-DNA綴合物、B-DNA綴合物、C-DNA綴合物、S30-S40模板鏈和S50-S60模板鏈混合,以27%的組裝產(chǎn)率合成具有寡聚序列S2-A-B-C-S1的蛋白質(zhì)三聚體并通過瓊脂糖凝膠電泳對(duì)其進(jìn)行表征(Fig. 3C,3E: lane 5)。此外,作者使用抗原結(jié)合和檢查點(diǎn)抑制劑活性細(xì)胞測(cè)定法研究了用DNA功能化和用模塊化DNA支架寡聚后人抗體的靶向結(jié)合特性。結(jié)果表明,每個(gè)樣品中保留了抗原結(jié)合和檢查點(diǎn)抑制劑活性。
最后,作者使用蛋白質(zhì)二聚體和三聚體作為構(gòu)建模塊成功合成了具有寡聚序列S4–B–C–A–B–C–S1的單分散和序列編碼的蛋白質(zhì)五聚體,其中三種不同的抗體被組織成精確的低聚物序列(Fig. 3D,3E: lane 6)。這是第一個(gè)報(bào)道的單分散抗體五聚體,其包含預(yù)定義寡聚序列中的不同抗體。
總結(jié):
Chad A. Mirkin院士團(tuán)隊(duì)展示了如何使用可推廣的生物偶聯(lián)化學(xué)和精心設(shè)計(jì)的DNA支架合成單分散、序列編碼的蛋白質(zhì)低聚物。因?yàn)檫@種通用的蛋白質(zhì)低聚方法可以合成具有不同化學(xué)計(jì)量和低聚物序列的低聚物,而無需重新設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)或DNA支架,表現(xiàn)出了其強(qiáng)大性和實(shí)用。更為重要的是,這一合成進(jìn)展將使后續(xù)研究和理解蛋白質(zhì)低聚物結(jié)構(gòu)和性質(zhì)之間的基本關(guān)系成為可能,這對(duì)許多領(lǐng)域(如治療學(xué)、催化、光合作用和膜運(yùn)輸)具有重大意義。
聲明:化學(xué)加刊發(fā)或者轉(zhuǎn)載此文只是出于傳遞、分享更多信息之目的,并不意味認(rèn)同其觀點(diǎn)或證實(shí)其描述。若有來源標(biāo)注錯(cuò)誤或侵犯了您的合法權(quán)益,請(qǐng)作者持權(quán)屬證明與本網(wǎng)聯(lián)系,我們將及時(shí)更正、刪除,謝謝。 電話:18676881059,郵箱:gongjian@huaxuejia.cn