欧美色盟,色婷婷AV一区二区三区之红樱桃,亚洲精品无码一区二区三区网雨,中国精品视频一区二区三区

近些年發(fā)現(xiàn)的CRISPR/Cas12a分子檢測(cè)技術(shù)與RPA擴(kuò)增表現(xiàn)出了良好的互補(bǔ)性：RPA擴(kuò)增可顯著提高CRISPR/Cas12a的檢測(cè)靈敏度，CRISPR/Cas12a技術(shù)能夠消除RPA非特異性擴(kuò)增產(chǎn)生的假陽(yáng)性信號(hào)[1]。但是，RPA擴(kuò)增和CRISPR/Cas12a反應(yīng)的簡(jiǎn)單混合通常會(huì)導(dǎo)致靈敏度的急劇下降或檢測(cè)時(shí)間的延長(zhǎng)，其主要原因是模板DNA和擴(kuò)增子激活Cas12a酶的切割活性后，會(huì)被順式切割導(dǎo)致模板失效；與此同時(shí)激活后的Cas12a核酸酶還會(huì)反式切割單鏈引物，造成RPA擴(kuò)增效率急劇下降[2]。為避免擴(kuò)增子轉(zhuǎn)移造成的氣溶膠污染，目前大多數(shù)的RPA擴(kuò)增和CRISPR技術(shù)結(jié)合的研究都是在密封體系內(nèi)將RPA擴(kuò)增和CRISPR檢測(cè)物理分隔。如：王永明將CRISPR體系加至PCR管蓋上，擴(kuò)增完成后經(jīng)過(guò)離心步驟混合進(jìn)行后續(xù)的CRISPR反應(yīng)[3]；劉長(zhǎng)春團(tuán)隊(duì)利用蔗糖的濃度梯度分隔RPA擴(kuò)增和CRISPR反應(yīng)[4]。這些方法雖然實(shí)現(xiàn)了“閉管”檢測(cè)，但對(duì)操作要求較高，與即時(shí)診斷（Point of Care Test, POCT）策略相背。因此，開(kāi)發(fā)出易于推廣的、可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的RPA-CRISPR“閉管”檢測(cè)新方法對(duì)于RPA恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的商業(yè)化應(yīng)用具有重要的意義。

2022年6月28日，深圳大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院劉翼振副教授在Analytical Chemistry上發(fā)表了題為“Photoactivatable CRISPR/Cas12a strategy for One-pot DETECTR Molecular Diagnosis”的研究。該研究利用光控技術(shù)精確控制CRISPR/Cas12a反應(yīng)的開(kāi)啟，避免了RPA擴(kuò)增初期Cas12a核酸酶對(duì)模板、擴(kuò)增子以及引物的消耗，解決了RPA-CRISPR反應(yīng)簡(jiǎn)單混合導(dǎo)致的靈敏度急劇下降和檢測(cè)時(shí)間延長(zhǎng)等問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)了“閉管”的、無(wú)需擴(kuò)增子轉(zhuǎn)移的、高靈敏的分子診斷。

在基因編輯領(lǐng)域，“光激活”作為一種無(wú)創(chuàng)、快速、高分辨率的生化反應(yīng)開(kāi)關(guān)常常被用于Cas9技術(shù)在體內(nèi)基因編輯的控制器[5,6]。受此啟發(fā)，作者提出光控的RPA-CRISPR/Cas12a分子檢測(cè)新技術(shù)：設(shè)計(jì)能夠與crRNA完全互補(bǔ)的、中間穿插有光解基團(tuán)的PC-DNA，二者雜交后能夠阻止crRNA形成“發(fā)卡”結(jié)構(gòu)與Cas12a核酸酶結(jié)合，從而阻斷CRISPR/Cas12a反應(yīng)（圖1a）。所以，在檢測(cè)的前15 min，RPA擴(kuò)增可以在無(wú)干擾的情況下迅速生成大量擴(kuò)增子。然后使用365 nm紫外光照射3 min使光解基團(tuán)PC-DNA斷裂并從crRNA上解離，釋放出的crRNA與Cas12a結(jié)合并被擴(kuò)增子激活。因此，在檢測(cè)的后20 min，CRISPR/Cas開(kāi)啟反式切割迅速切斷熒光報(bào)告鏈產(chǎn)生熒光信號(hào)（圖1b）。

圖1 光控的RPA-CRISPR/Cas“閉管”檢測(cè)（圖源：Chen Y, et  al., Anal Chem, 2022）

基于此，作者設(shè)計(jì)了W-PC-DNA、F-PC-DNA和R-PC-DNA三種PC-DNA分別與crRNA的全長(zhǎng)序列、發(fā)卡序列和識(shí)別序列互補(bǔ)，用以測(cè)試其保護(hù)效果。結(jié)果表明只有完全封閉crRNA的全長(zhǎng)序列時(shí)，檢測(cè)體系才能夠達(dá)到預(yù)期的效果，并且PC-DNA的最優(yōu)加入量為crRNA的2倍（圖2a）。為了縮短整體檢測(cè)時(shí)間，作者進(jìn)一步證實(shí)了在低濃度模板（25 copies）下，RPA預(yù)擴(kuò)增和光激活CRISPR所需的最短時(shí)間分別為15 min和3 min，因此整個(gè)的檢測(cè)過(guò)程為38 min（圖2b）。

圖2 光控的RPA-CRISPR/Cas檢測(cè)條件優(yōu)化（圖源：Chen Y, et  al., Anal Chem, 2022）

 最后，作者利用這一技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)非洲豬瘟（African Swine Fever Virus, ASFV）的快速檢測(cè)。進(jìn)一步的，作者以豬圓環(huán)病毒2型（Porcinecircovirus Type 2, PCV2）、豬偽狂犬病毒（Pseudorabies Virus, PRV）作為對(duì)比驗(yàn)證了其特異性，并且證實(shí)了該檢測(cè)體系的檢測(cè)靈敏度達(dá)到了2.5 copies/reaction（圖3a）。與常規(guī)的先RPA擴(kuò)增后CRISPR/Cas加入的分步式檢測(cè)方法相比，光控的RPA-CRISPR“閉管”檢測(cè)方法在靈敏度一致的前提下，極大地簡(jiǎn)化了操作流程（圖3b）。

圖3 光控的RPA-CRISPR/Cas檢測(cè)與分步檢測(cè)對(duì)比（圖源：Chen Y, et  al., Anal Chem, 2022）

綜上所述，本研究建立了一種光激活、“閉管”的RPA-CRISPR/Cas分子診斷新方法，并將其用于非洲豬瘟病毒的快速檢測(cè)。該研究利用互補(bǔ)的、含有光解基團(tuán)的PC-DNA與crRNA雜交從而阻斷CRISPR/Cas12a反應(yīng)，然后擴(kuò)增完成后通過(guò)365 nm紫外光照釋放crRNA恢復(fù)CRISPR/Cas12a的活性進(jìn)行核酸檢測(cè)。該方法在“閉管”系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)了RPA擴(kuò)增-光激活CRISPR/Cas12a檢測(cè)的精確控制，解決了傳統(tǒng)RPA-Cas12a集成檢測(cè)中由于競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)導(dǎo)致靈敏度降低和檢測(cè)時(shí)間延遲的問(wèn)題。整個(gè)檢測(cè)時(shí)間僅為40 min，檢測(cè)靈敏度為2.5 copies。與目前的分離RPA-CRISPR/Cas檢測(cè)相比，該方法操作簡(jiǎn)單、控制精準(zhǔn)、避免了擴(kuò)增子轉(zhuǎn)移帶來(lái)的氣溶膠污染問(wèn)題。這種光激活的RPA-CRISPR/Cas12a“閉管”檢測(cè)方法在POCT核酸檢測(cè)中將發(fā)揮重要作用，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

深圳大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院副研究員陳勇為研究論文的第一作者，劉翼振副教授為通訊作者。該研究獲得了國(guó)家自然科學(xué)基金委員會(huì)、廣東省自然科學(xué)基金、深圳市科技創(chuàng)新委員會(huì)、深圳大學(xué)的大力支持。

通訊作者課題組簡(jiǎn)介：

劉翼振團(tuán)隊(duì)成員長(zhǎng)期從事DNA等溫信號(hào)放大技術(shù)、DNA級(jí)聯(lián)電路、核酸等溫?cái)U(kuò)增及CRISPR分子診斷技術(shù)的研究工作。研究?jī)?nèi)容主要圍繞生物傳感技術(shù)與分子診斷技術(shù)，結(jié)合分析化學(xué)、分子生物學(xué)及生物醫(yī)學(xué)工程開(kāi)展新型分子診斷技術(shù)的交叉研究。近五年在ACS Nano、Advanced Science、Chemical Science、Analytical Chemistry、Journal of Materials Chemistry A、Chemical Communications、Topics in Current Chemistry、Analytica Chimica Acta、Talanta 等期刊發(fā)表多篇研究論文。長(zhǎng)期擔(dān)任ACS Nano、Advanced Materials、Advanced Functional Materials、Chemical Communications和Nanoscale 等期刊的審稿人。團(tuán)隊(duì)隸屬于深圳市納米生物傳感技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、深圳大學(xué)納米傳感與分子診療研究中心。

原文鏈接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.2c01193

1. Chen, Y.; Mei, Y. X.; Zhao, X. H.; Jiang, X. Y., Reagents-Loaded, Automated Assay that Integrates Recombinase-Aided Amplification and Cas12a Nucleic Acid Detection for a Point-of-Care Test. Anal. Chem. 2020, 92, 14846-14852.

2. Chen, Y.; Zong, N.; Ye, F. D.; Mei, Y. X.; Qu, J. X.; Jiang, X. Y., Dual-CRISPR/Cas12a-Assisted RT-RAA for Ultrasensitive SARS-CoV-2 Detection on Automated Centrifugal Microfluidics. Anal. Chem. 2022, 94, 9603-9606.

3. Wang, B.; Wang, R.; Wang, D. Q.; Wu, J.; Li, J. X.; Wang, J.; Liu, H. H.; Wang, Y. M., Cas12aVDet: A CRISPR/Cas12a-Based Platform for Rapid and Visual Nucleic Acid Detection. Anal. Chem. 2019, 91, 12156-12161.

4. Yin, K.; Ding, X.; Li, Z. Y.; Zhao, H.; Cooper, K.; Liu, C. C., Dynamic Aqueous Multiphase Reaction System for One-Pot CRISPR-Cas12a-Based Ultrasensitive and Quantitative Molecular Diagnosis. Anal. Chem. 2020, 92, 8561-8568.

5. Jain, P. K.; Ramanan, V.; Schepers, A. G.; Dalvie, N. S.; Panda, A.; Fleming, H. E.; Bhatia, S. N., Development of Light-Activated CRISPR Using Guide RNAs with Photocleavable Protectors. Angew. Chem. Int. Ed. 2016, 55, 12440?12444.

6. Moroz-Omori, E. V.; Satyapertiwi, D.; Ramel, M. C.; Hogset, H.; Sunyovszki, I. K.; Liu, Z. Q.; Wojciechowski, J. P.; Zhang, Y. Y.; Grigsby, C. L.; Brito, L.; Bugeon, L.; Dallman, M. J.; Stevens, M. M., Photoswitchable gRNAs for Spatiotemporally Controlled CRISPRCas-Based Genomic Regulation. ACS Cent. Sci. 2020, 6, 695?703.