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DNA在內源性或外源性因素的持續攻擊下形成的異常結構被稱為DNA損傷。人體中的DNA損傷與衰老、神經退行性疾病、腫瘤等密切相關，繪制DNA損傷在基因組中的分布對于深入解讀其致病機制、研究DNA損傷修復耐受性、開發癌癥診療策略、評估抗腫瘤藥物療效等方面均有著深遠意義。然而，目前測序DNA損傷的工具十分匱乏，由于DNA損傷的致突變以及復制阻滯特性，其信息難以通過二代測序技術讀取。面對類型多樣的DNA損傷，目前僅有極少數的DNA損傷借助二代測序與抗體富集/化學標記相結合的方法實現了測序，且難以避免抗體或化學標記策略特異性不足的問題，從原理上講，通過二代測序同時表征DNA中不同類型的DNA損傷也是極為困難的。因此，引入新的DNA損傷測序方法對于推動DNA損傷相關的基礎研究以及相應疾病診療方案的開發而言十分重要。

納米孔測序作為第三代單分子測序技術，具有直接測序核酸的技術優勢，在直接表征廣泛的核酸序列修飾或損傷方面極具潛力。然而，常規的納米孔測序分析（圖1A, Detection mode I）會產生測序錯誤，如對于目標修飾堿基的分辨率不足或檢測受序列環境干擾而產生錯讀，以及目標堿基過孔速度太快而造成漏檢。

近日，南京大學黃碩教授課題組在Nano letters上報道了一種新型通過在納米孔測序中監測聚合酶阻滯動力學的DNA損傷測序方法（圖1 A, Detection mode II），利用單分子水平上DNA損傷與聚合酶活性位點間相互作用匯報出的酶阻滯動力學特征，成功實現了三種烷基化試劑誘導形成的致突變性與致癌性DNA堿基損傷O⁶-羧甲基鳥苷（O⁶-carboxymethylguanosine，O⁶-CMG）、O⁶-甲基鳥苷（O⁶-methylguanosine，O⁶-MeG）與無堿基位點（abasic site, AP site）的準確區分（圖1B）。并且，該方法也為常規納米孔測序中出現的測序錯誤提供了解決方案。

圖1. 通過在納米孔測序中監測聚合酶阻滯動力學區分DNA損傷的概念演示。 

DNA損傷在納米孔測序中產生了具有高度一致性的聚合酶阻滯信號，表現為兩個重復的電流平臺之間的持續波動（圖2A）。從測序事件中繪制出酶沿DNA模板位置移動的軌跡，揭示了聚合酶在DNA損傷位點發生了阻滯（圖2B）。聚合酶阻滯顯著延長了DNA損傷通過孔道的總體時間，有助于規避在納米孔測序中因目標堿基損傷太快通過孔道而產生漏檢的測序錯誤。酶阻滯動力學特征分析結果顯示，單分子聚合酶阻滯動力學能為DNA堿基損傷提供可靠的、不易受序列環境干擾的檢測指標（圖2C-D），不同于受目標修飾堿基周圍序列影響而產生測序錯誤的常規納米孔測序讀取，酶動力學特征可能有助于檢測未知序列環境中的DNA損傷或修飾。O⁶-CMG、O⁶-MeG和AP site三種DNA損傷能夠通過各自的單分子酶阻滯動力學特征實現準確區分（圖2E），而標準納米孔測序會造成O⁶-MeG的誤讀，且難以區分O⁶-CMG和AP site（圖3），充分驗證了酶阻滯動力學策略用于DNA損傷檢測的可行性及檢測能力。

圖2. 利用單分子聚合酶阻滯動力學鑒定DNA損傷。  

圖3. 利用常規納米孔測序分析鑒定DNA損傷。 

該工作以“Discrimination between Different DNA Lesions by Monitoring Single-Molecule Polymerase Stalling Kinetics during Nanopore Sequencing”為題，于2022年6月17日發表于《Nano letters》（文章鏈接：https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acs.nanolett.2c01833，DOI: 10.1021/acs.nanolett. 2c01833）。南京大學博士生張金月與碩士生王宇為論文的共同第一作者，南京大學黃碩教授為論文的通訊作者，陳洪淵院士對該工作做出了重要指導。此項研究得到了生命分析化學國家重點實驗室以及南京大學化學和生物醫藥創新研究院（ChemBIC）的重要支持，與國家自然科學基金（項目編號：31972917，91753108，21675083）、中央高校基本科研業務費資助（項目編號：020514380257，020514380261）、江蘇省高層次創業創新人才引進計劃（個人、團體計劃）、江蘇省自然科學基金（項目編號：BK20200009）、南京大學卓越計劃（項目編號：ZYJH004）、上海市市級科技重大專項、南京大學生命科學分析化學國家重點實驗室（項目編號：5431ZZXM1902）、南京大學科技創新基金資助項目、中國博士后科學基金（項目編號：2021M691508）等經費支持。

參考資料：https://chem.nju.edu.cn/df/29/c12639a581417/page.htm