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G蛋白偶聯受體（GPCRs）是真核生物中最大的一類膜蛋白，在感知胞外信號和介導胞內信息轉導中發揮了重要作用，并參與調控多種生理過程，與人類疾病密切相關，是最重要的藥物靶標蛋白家族。GPCR與第二信使環磷酸腺苷相關的信號通路中，主要通過刺激型G蛋白（G_s）和抑制型G蛋白（G_i）來區分細胞內不同的信號傳遞方式。了解受體對G_s和G_i信號通路的選擇性機制是GPCR和相關信號轉導領域長期以來的重要科學問題。

5-羥色胺（serotonin, 5-HT）是人體中樞神經系統和周圍神經系統的主要神經遞質之一，其通過結合5-羥色胺受體（5-HTR）發揮調控食欲、記憶、認知，情緒調節和成癮等重要的生理過程，這也使5-羥色胺受體成為抑郁癥、精神分裂癥、偏頭痛等疾病的重要治療靶點。5-羥色胺受體家族是GPCR超家族中最復雜的亞家族之一，其包含12種亞型，不同亞型的受體在人體中發揮不同的生理功能，并且與不同種類的G蛋白偶聯。其中5-HT₄、5-HT₆和5-HT₇受體主要偶聯下游G_s蛋白，5-HT₁和5-HT₅受體主要偶聯下游G_i蛋白。對于在同一內源性配體5-HT激活后，不同亞型的5-羥色胺受體如何偏好地偶聯下游G蛋白來調控細胞應答一直困擾著研究人員。

2022年6月16日，中科院上海藥物研究所徐華強研究員團隊，聯合浙江大學張巖教授團隊以及丹麥哥本哈根大學David E. Gloriam教授團隊等，經歷一年投稿，在Molecular Cell雜志上在線發表了最新的研究成果“GPCRs steer Gi and Gs selectivity via TM5-TM6 switches as revealed by structures of serotonin receptors”，取得了5-羥色胺受體結構和功能領域又一突破性進展，成功解析了5-HT₄、5-HT₆、5-HT₇受體與激活型G蛋白（G_s蛋白）和5-HT₄受體與抑制型G蛋白（G_i蛋白）結合的復合物三維結構。他們系統性地揭示了小分子配體5-HT和5-CT識別5-羥色胺受體亞型的結構基礎，并闡明了5-羥色胺受體選擇性偶聯G_s蛋白和G_i蛋白的分子機制。

聯合團隊采用單顆粒冷凍電鏡技術分別對5-HT激活5-HT₄、5-HT₆形成的G_s復合物、5-CT激活5-HT₇形成的G_s復合物和5-HT激活5-HT₄形成的G_i復合物進行了結構重塑，最終解析了4個在配體激活狀態下與不同蛋白的復合物結構，其中5-HT-5-HT₄-G_s復合物結構的分辨率為3.1埃，5-HT-5-HT₆-G_s復合物結構的分辨率為3.3埃，5-CT-5-HT₇-G_s復合物結構的分辨率為3.2埃，5-HT-5-HT₄-G_i復合物結構的分辨率為3.2埃（圖1）。

圖1. 5-HT₄、5-HT₆和5-HT₇受體結構

該團隊將所獲的這三種G_s偶聯的5-羥色胺受體與G_i偶聯的5-羥色胺受體進行了結構比較，并進一步與另外已發表的19種G_s和G_i偶聯的A類GPCRs結構進行比較。他們發現，跨膜螺旋TM5和TM6長度作為“macro-switch”來分別確定受體對G_s和G_i的選擇性，且這種TM5-TM6 長度的“macro-switch”由A類GPCRs-G蛋白結構共享。此外，TM5和TM6中的特定殘基充當“micro-switches”以與G_s或G_i形成特定的相互作用。這些結果展示了A類GPCRs的 G_s和G_i蛋白偶聯選擇性或混雜的共同機制（圖2）。

為探究G蛋白偏好5-羥色胺受體的假設，該團隊進行了兩組實驗來檢驗TM5和TM6的長度是GPCR區分G_s和G_i蛋白的關鍵因素的假設。第一組實驗是將5-HT_1A受體的TM6末端螺旋斷裂并且TM5螺旋延伸或5-HT₄、5-HT₇受體的TM5末端螺旋斷裂并且TM6螺旋延伸，功能結果表明這種改造影響了5-HT₄、5-HT₇受體偶聯G_s蛋白的能力，然后將5-HT_1A受體由原來G_i偶聯轉變成了G_s偶聯，這些結果支持TM5和TM6長度的“macro-switch”是G蛋白選擇性的關鍵。第二組實驗是將G_i偶聯的5-HT_1A的TM5-TM6區域與G_s偶聯的5-HT₄和5-HT₇受體的TM5-TM6區域互換。研究結果表明，嵌合受體5-HT_1A (5-HT₄_P5.50-P6.50)與野生型5-HT₄具有相似的功能，即具有高組成型激活且幾乎不受配體調節。同樣，5-HT_1A (5-HT₇_P5.50-P6.50)顯示出與野生型5-HT7相似的功能，在激動劑誘導下進行的cAMP 積累。如果將5-HT₄和5-HT₇的ICL3替換為5-HT_1A，在激動劑誘導下進行的cAMP積累的能力幾乎喪失，類似于野生型5-HT_1A受體。綜上所述，該團隊以5-羥色胺家族受體為切入點揭示了A類GPCRs的G_s、G_i蛋白偶聯選擇性機制，并擴展了5-羥色胺受體的配體識別基礎。

圖2. 5-羥色胺受體TM5、TM6對G蛋白選擇性偶聯的影響

徐華強團隊長期致力于5-羥色胺家族受體的結構與功能研究，并取得了一系列系統性的重要成果。2013年，該團隊于在Science上首次報導了激動劑結合的5-HT_1B受體的高分辨率晶體結構¹。2018年，該團隊在Cell Discovery發表了首個反向激動劑結合的5-HT_1B受體的晶體結構²。2021年3月，該團隊在Nature上首次報道了5-HT_1A、5-HT_1D、5-HT_1E受體的結構，并揭示了磷脂PI4P（PtdIns4P）和膽固醇調節受體功能的機制和受體的本底激活機制³。2021年7月，該團隊在Cell Research上首次報道了5-HT1F受體的結構，并揭示了偏頭痛藥物拉米替坦對該受體的選擇性結合機制⁴。2022年5月，該團隊在Cell Discovery上首次報道了5-HT_5A受體的結構⁵。

在前期研究基礎上，該成果不僅揭示了A類GPCR選擇性偶聯G蛋白的分子機制，還填補了5-HT家族受體結構解析的最后空白。該成果首次報道5-HT₄、5-HT₆、5-HT₇受體結構，使所有12種5-HT受體亞型的結構均得到了解析。這些在5-羥色胺受體上系統性的研究極大地豐富我們對5-羥色胺系統的結構與功能認識，并為開發治療抑郁癥、精神分裂癥、偏頭痛等疾病的藥物提供了重要基礎。

本課題由徐華強研究員領銜，聯合浙江大學張巖教授和丹麥哥本哈根大學的David E. Gloriam教授團隊等，精誠合作，全力攻關，并在中國科學院上海藥物研究所蔣軼研究員和余學奎研究員的協助下完成。上海藥物研究所黃思婕博士和徐沛雨博士、浙江大學基礎醫學院研究助理沈丹丹和丹麥哥本哈根大學的Icaro A. Simon為本文共同第一作者。

參考文獻：

1.Wang, C. et al. Structural basis for molecular recognition at serotonin receptors. Science 340, 610-614 (2013).

2.Yin, W. et al. Crystal structure of the human 5-HT1B serotonin receptor bound to an inverse agonist. Cell discovery 4, 1-13 (2018).

3.Xu, P. et al. Structural insights into the lipid and ligand regulation of serotonin receptors. Nature 592, 469-473 (2021).

4.Huang, S. et al. Structural basis for recognition of anti-migraine drug lasmiditan by the serotonin receptor 5-HT1F–G protein complex. Cell Research 31, 1036-1038 (2021).

5.Tan, Y. et al. Structural insights into the ligand binding and Gi coupling of serotonin receptor 5-HT5A. Cell discovery 8, 1-9 (2022).

文章鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1097276522005299?dgcid=coauthor

參考資料：http://www.simm.cas.cn/web/xwzx/kydt/202206/t20220617_6462601.html