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研究背景

在哺乳動物天然免疫系統中，來源于腫瘤或微生物的胞質DNA可激活cGAS合成第二信使—環二核苷酸2’, 3’-cGAMP1,2（cGAMP）。cGAMP與STING結合使其形成二聚體，招募TBK1，磷酸化并激活IRF3，誘導I 型干擾素和其他細胞因子的表達。cGAMP-STING免疫信號通路在機體抗腫瘤和抗感染等過程中發揮著非常重要的作用。
腫瘤細胞和感染細胞中的的cGAMP往往需要轉移到“旁觀者”細胞中，從而全局性地調動STING介導的干擾素反應和抗腫瘤/抗病毒免疫。此外，免疫治療中使用的外源cGAMP以及其它一些由細菌產生的環二核苷酸（如3’, 3’-cGAMP）也需穿過細胞膜來激活機體多細胞免疫反應。然而，由于cGAMP帶負電且具有高度親水性，導致其很難自發穿過磷脂雙層進入靶細胞內發揮作用。因此，研究cGAMP的跨膜運輸對闡明宿主免疫防御機制和改善cGAMP免疫治療效果都具有極其重要的意義。近年來，科學家逐步發現細胞間gap junction3和細胞膜上陰離子通道蛋白（SLC19A14和LRRC85,6）可以作為cGAMP的跨膜轉運系統。但是，機體內是否存在溶解性的、游離的蛋白或多肽參與cGAMP跨膜轉運目前尚不清楚。

研究過程

該研究團隊通過大范圍篩選成功鑒定到一條人類細胞中的游離多肽LL-37可協助cGAMP進入細胞。LL-37是Cathelicidin抗菌肽家族的唯一人類成員，具有抗菌、抗病毒、免疫調節、促進傷口愈合等多種生物學功能7。研究者發現，在LL-37的協助下，cGAMP能夠強烈激活STING信號通路，并誘導大量的IFNβ的產生。LL-37對cGAMP免疫反應的促進作用甚至高于細胞溶孔素PFO和細胞透化劑Digitonin（圖1）。此外，LL-37對于細菌來源的3’, 3’-cGAMP也具有類似的促進作用（見原文Figure S1D）。值得一提的是，LL-37具有極高的熱穩定性，80℃高溫處理半小時幾乎不會影響其對cGAMP的免疫促進活性（見原文Figure S1B）。這些獨特的生化特性表明LL-37-cGAMP復合制劑在免疫調節和治療方面具有巨大的潛力。

  
圖1. LL-37促進cGAMP強烈激活STING信號通路和干擾素反應 

為了進一步探究機體內源性LL-37是否也可以發揮相似的功能，研究者用兩種LL-37誘導劑（維生素D [VD3] 和丁酸鈉 [SB]）誘導內源LL-37的表達。結果表明，在人THP1和Caco2細胞上，VD3和SB都能夠顯著增強cGAMP介導的STING信號通路的激活。然而，當敲除LL-37基因后，VD3和SB對cGAMP免疫反應的增強作用完全喪失，表明VD3和SB通過誘導內源LL-37表達促進cGAMP介導的STING信號傳導（圖2）。前人研究表明，人體上皮細胞、唾液以及感染或炎癥部位的LL-37濃度可達2-12 μg/ml8,9。該研究團隊證明，此生理濃度下的LL-37足以有效促進cGAMP誘導的免疫反應，同時強效抑殺G＋和G－致病菌（見原文Figure S2）。

  
圖2. VD3和SB通過誘導內源LL-37表達促進cGAMP介導的STING信號激活 

接著，該研究團隊詳細解析了LL-37促進cGAMP-STING免疫反應的分子機制。作為一種游離的兩親性陽離子肽，LL-37可以自由穿梭細胞膜（見原文Figure 4E）。通過設計精妙的細胞間cGAMP轉移試驗，研究者發現LL-37不但可以將HEK293T細胞內產生的cGAMP跨膜轉運到培養基中（圖3C），而且可以將該HEK293T細胞培養基中cGAMP再次高效轉運到THP1-Lucia ISG細胞內（圖3D）。通過ITC、MST等試驗手段，研究者發現LL-37通過與cGAMP特異性結合對cGAMP進行跨細胞膜運輸（圖3F）。綜之，LL-37通過與cGAMP結合雙向跨膜轉運cGAMP。

  
圖3. LL-37通過與cGAMP特異性結合雙向跨膜轉運cGAMP 

此外，該研究團隊發現LL-37通過對cGAMP進行跨膜轉運顯著增強了宿主的抗病毒免疫反應。研究者發現LL-37強烈促進了cGAMP誘導的ISG基因的表達，包括CXCL10、IFITM1、MX1、Viperin、ISG15和IFIT3（圖4F）。此外，LL-37和cGAMP的組合明顯增加了小鼠血清中的IFNβ和CXCL10水平（圖4G）。與單獨使用cGAMP或LL-37相比，cGAMP-LL-37能夠更好地緩解HSV-1誘導的小鼠體重下降癥狀（圖4C）。更重要的是，LL-37-cGAMP組合幾乎完全消除了THP1細胞（圖4A和4B）和小鼠脾臟（圖4D和4E）中的病毒感染。
       

圖4. LL-37-cGAMP可以強烈激活宿主抗病毒免疫

研究表明補充VD3可以增強基于IFNβ的抗病毒反應10，并有證據顯示補充VD3甚至可以緩解新型冠狀病毒SARS-CoV-2誘發的急性呼吸道綜合征11。盡管早有研究報道VD3能夠誘導內源性LL-37的產生12，但尚不清楚VD3誘導的LL-37表達與IFNβ介導的抗病毒反應之間是否存在聯系。該研究（見原文Figure S5和S6）證明，VD3通過誘導內源LL-37的表達，促進了cGAMP的跨膜轉運，從而高效激活STING信號通路并促進IFNβ介導的抗病毒免疫反應，解開了這個困擾人類幾十年的謎題。

綜之，該研究首次發現人類宿主防御肽LL-37可作為cGAMP的轉運體高效激活STING介導的先天免疫反應（圖5），為機體免疫調節和抗感染機制提供新的見解，并為臨床免疫治療提供了新思路。

  
圖5. LL-37跨膜轉運cGAMP以激活STING信號通路并增強IFN介導的宿主抗病毒免疫的示意圖 

清華大學藥學院張從剛研究員和上海交通大學基礎醫學院孫序序研究員為該論文通訊作者，張從剛課題組博士后衛旭彪和張璐璐為該論文第一作者，張從剛課題組楊銀龍、侯燕飛等多位同學在該課題實施過程中提供了大量幫助，清華大學藥學技術中心為該研究提供了技術支持。該研究得到了國家自然科學基金項目（32070875，31970587）、清華-北大生命科學聯合中心、中國博士后科學基金（2021M691812，2021M701923）以及上海東方學者基金（TP2018045）的資助。
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原文鏈接：https://mp.weixin.qq.com/s/kP6BUdH-EO3LVYEqAOchaA

參考資料：http://www.sps.tsinghua.edu.cn/cn/news/achievement/2022/0603/850.html