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2022年5月4日，北京大學生命科學學院、生命聯合中心鄧宏魁課題組與李程課題組、北京大學醫學部基礎醫學院徐君課題組在Cell Research雜志上發表了題為“Derivation of totipotent-like stem cells with blastocyst-like structure forming potential”的研究論文。該研究通過化學小分子篩選組合，建立了一個新的全能性干細胞培養條件，可以支持從小鼠二細胞胚胎及擴展型多能干細胞（EPS細胞）建立全能性干細胞系。這種新型全能性干細胞可在體外長期穩定培養，在分子特征和發育潛能上與小鼠二細胞胚胎高度相似，并且可以在體外被誘導形成在轉錄組水平上類似于體內囊胚的類囊胚結構。

如何在體外制備全能性干細胞，長期以來一直是干細胞領域的重要科學問題。在小鼠中，只有受精卵及二細胞胚胎具有全能性：單個細胞能夠形成一個完整生命個體。隨后發育形成的囊胚細胞可以被用于建立多潛能干細胞，滋養層干細胞及原始內胚層干細胞。然而，這些干細胞的發育潛能是受限的，無法同時發育到胚內和胚外組織。近年的研究發現：在小鼠多能干細胞群中存在極少量的表達小鼠二細胞胚胎分子標記MERVL的細胞，被稱為二細胞樣細胞（2-cell like cells），具有二細胞胚胎的部分分子特征(1)。然而，這種細胞無法在體外進行穩定的培養。此外，最近的研究發現，二細胞樣細胞與體內二細胞胚胎仍存在較大差異，作為體外研究全能性的模型仍存在較大局限性（2）。

北京大學鄧宏魁團隊長期以來致力于采用化學小分子調控的手段來建立調控干細胞的發育潛能的新方法（3-6）。2017年鄧宏魁團隊報道了一個新的小分子組合（LCDM），可以在人和小鼠中建立擴展型多能干細胞（EPS細胞）（4）。EPS細胞具有胚內胚外發育潛能，并且可以被誘導形成類囊胚（Blastoid）結構（7）。然而，與小鼠二細胞胚胎相比，這種細胞的分子特征與二細胞胚胎還有較大差異，細胞的胚外分化潛能也存在局限性，誘導獲得的類囊胚結構中存在較高比例的中間態和中胚層樣細胞（8）。最近北京大學杜鵬團隊、中山大學王繼廠團隊等報道了全能性干細胞的誘導條件（9-10）。當前，如何直接自小鼠全能性胚胎建立全能性干細胞，仍是全能性干細胞研究的“金標準”。

在本研究中，團隊通過化學小分子高通量篩選，鑒定了能夠在EPS細胞中誘導提高MERVL及Zscan4陽性細胞比例的化學小分子。通過進一步的組合優化，發現了一個可以將EPS細胞誘導為全能性干細胞的小分子組合CD1530，VPA，EPZ004777，CHIR 99021 (CPEC組合)，誘導獲得的全能性干細胞能長期穩定地在體外培養。更為重要的是，CPEC組合可以在體外支持從小鼠二細胞胚胎直接建立全能性干細胞系。研究者將由CPEC組合支持建立的全能性干細胞命名為全能潛能干細胞（totipotent potential stem cells, TPS細胞）。

研究者進一步從轉錄組、表觀特征、嵌合能力等多個方面深入分析了TPS細胞的分子特征和發育潛能。他們發現TPS細胞在單細胞水平上表達大量的全能性特征基因，并且下調了多能性的分子標記。進一步的單細胞轉錄組分析發現，TPS細胞群中存在一個在轉錄組水平與中期二細胞胚胎高度相似的細胞亞群（約10%）。他們定量分析了TPS細胞、杜鵬團隊報道的TBLC中的全能干細胞亞群、二細胞樣細胞與二細胞胚胎的轉錄組相似度，發現TPS細胞中的全能干細胞亞群與二細胞胚胎的相似程度是最高的。ATAC-seq和全基因組甲基化分析也表明：TPS細胞具備了二細胞胚胎的表觀修飾特征。在發育潛能分析方面，他們通過在不同發育階段的單細胞嵌合實驗證明了：單個TPS細胞具備了同時向胚內和胚外發育的能力。為了嚴格證明TPS細胞在體內的胚外發育潛能，他們對E17.5的嵌合胎盤進行了單細胞轉錄組分析，結果表明TPS來源的細胞可以分化形成多種胚外滋養層細胞類型。并且，他們發現tdTomato標記的TPS細胞與有GFP標記的受體胚胎形成的嵌合胎盤中，存在大量的tdTomato單陽性嵌合細胞，高表達滋養層細胞的分子標記，排除了由細胞融合導致的假陽性可能。這些結果表明了TPS細胞具備了與二細胞胚胎相似的分子特征和發育潛能。

自組裝形成類囊胚結構的能力是評估細胞全能性最為關鍵的功能性標準之一。研究者證明了通過調控早期胚胎發育的信號通路，可誘導TPS細胞高效形成類囊胚結構。單細胞轉錄組分析表明，TPS誘導的類囊胚結構中存在與小鼠E4.5囊胚中類似的上胚層、滋養外胚層、原始內胚層細胞，并且在轉錄組水平上高度相似。通過轉錄組數據的定量分析，研究者進一步比較了TPS-類囊胚結構中的滋養層細胞、小鼠滋養層干細胞/多能干細胞組合誘導類囊胚中的滋養層細胞，發現TPS-類囊胚結構中的滋養層細胞更類似于著床前囊胚中的小鼠滋養外胚層細胞。并且，不同于EPS細胞誘導的類囊胚結構，TPS-類囊胚結構中并不存在大量的中間態細胞及中胚層樣細胞。將TPS來源的類囊胚結構植入體內后，可以誘導蛻膜化反應，但是仍無法像正常囊胚那樣發育成個體，提示誘導類囊胚的方案仍需優化。

最后，研究者分析了CPEC組合在TPS細胞中誘導和調控全能性的分子機制。他們發現抑制HDAC1/2和Dot1L的活性、以及特異激活RARγ通路，對TPS細胞的誘導和維持具有重要作用。有趣的是，當用CPEC組合的小分子聯合處理小鼠二細胞胚胎時，他們發現這些小分子處理能在一定程度上幫助維持小鼠胚胎中的全能性分子標記的表達。這些結果表明HDAC1/2、Dot1L、RARγ通路的協同調控對于小鼠全能性調控的重要作用。

綜上所述，該研究利用化學調控的方法從小鼠二細胞胚胎中建立了新型的全能性干細胞，該細胞具有與二細胞胚胎相似的分子特征及雙向發育潛能，能夠形成與體內著床前囊胚更相似的類囊胚結構。這一工作不僅為體外研究全能性提供了更為合適和可靠的模型，而且朝著在不同哺乳動物物種中利用全能性胚胎捕捉、維持全能性干細胞的目標邁出了重要的一步。

鄧宏魁教授，李程研究員，徐君研究員是這一研究成果的共同通訊作者。北京大學徐亞星，趙晶薷，任奕璇，王旭陽和呂鈺麟為該研究成果的第一作者。本工作獲得了生命科學聯合中心、國家重點研發計劃項目、國家自然科學基金等支持。

原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41422-022-00668-0

參考文獻

1          Macfarlan, T. S. et al. Embryonic stem cell potency fluctuates with endogenous retrovirus activity. Nature 487, 57-63, doi:10.1038/nature11244 (2012).

2          Chen, Z., Xie, Z. & Zhang, Y. DPPA2 and DPPA4 are dispensable for mouse zygotic genome activation and pre-implantation development. Development (Cambridge, England) 148, doi:10.1242/dev.200178 (2021).

3          Fang, R. et al. Generation of naive induced pluripotent stem cells from rhesus monkey fibroblasts. Cell stem cell 15, 488-497, doi:10.1016/j.stem.2014.09.004 (2014).

4          Yang, Y. et al. Derivation of Pluripotent Stem Cells with In Vivo Embryonic and Extraembryonic Potency. Cell 169, 243-257.e225, doi:10.1016/j.cell.2017.02.005 (2017).

5          Qu, M. et al. Establishment of intestinal organoid cultures modeling injury-associated epithelial regeneration. Cell research 31, 259-271, doi:10.1038/s41422-020-00453-x (2021).

6          Liu, B. et al. Chemically defined and xeno-free culture condition for human extended pluripotent stem cells. Nature communications 12, 3017, doi:10.1038/s41467-021-23320-8 (2021).

7          Li, R. et al. Generation of Blastocyst-like Structures from Mouse Embryonic and Adult Cell Cultures. Cell 179, 687-702.e618, doi:10.1016/j.cell.2019.09.029 (2019).

8          Posfai, E. et al. Evaluating totipotency using criteria of increasing stringency. Nature cell biology 23, 49-60, doi:10.1038/s41556-020-00609-2 (2021).

9          Shen, H. et al. Mouse totipotent stem cells captured and maintained through spliceosomal repression. Cell 184, 2843-2859.e2820, doi:10.1016/j.cell.2021.04.020 (2021).

10        Yang, M. et al. Chemical-induced chromatin remodeling reprograms mouse ESCs to totipotent-like stem cells. Cell stem cell 29, 400-418.e413, doi:10.1016/j.stem.2022.01.010 (2022).

       參考資料：http://www.bio.pku.edu.cn/homes/Index/news_cont/22/16133.html