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苯甲醇是一種重要的中間體，能用于化學、制藥和聚合物工業中許多不同化合物的商業制備。目前苯甲醇的工業生產利用甲苯作為原料，通過化學法生成，該過程繁瑣且會生成大量副產物污染環境。因此，如何發展苯甲醇的綠色高效生產方法一直是工業界和學術界共同關注的問題。

近日，湖北大學生命科學學院、省部共建生物催化與酶工程國家重點實驗室李愛濤教授、陳純琪教授、郭瑞庭教授團隊共同合作，成功解決了這一難題。他們首次解析了P450tol及其復合體晶體結構，并基于此構建了一種活性和穩定性均明顯提升的人工融合酶，實現了苯甲醇的高效綠色合成，相關研究成果發表于國際權威期刊ACS Catalysis，并選為封面文章 (圖1)。

圖1.本研究獲選為ACS Catalysis封面文章。

萬能酶P450的神奇定向進化

在我們生活的地球上，“進化”是一股強大的力量。酶，這種地球上生命中最強大的化學工具，通過理性設計和定向進化手段，展現出了在生物催化領域的強大功能。其中，細胞色素P450酶能夠識別多種底物（參與生化反應的物質），利用基因工程改造P450酶來量身定制化學反應，成為一個熱門研究方向。2018年諾貝爾化學獎得主阿諾德教授，就是利用P450酶的定向進化實現各種特殊的化學反應而獲獎。

惰性C?H鍵的官能團化被認為是有機化學的圣杯，然而C?H鍵具有較高的解離能，通常具有較高的熱力學穩定性和較低的化學反應性，因此，C?H鍵官能團化是傳統化學合成中一個極大的難題。以重要的工業中間體苯甲醇為例，工業生產采取兩步法，以甲苯為原料，需要用到劇毒的氯氣和強堿氫氧化鈉，并產生有毒副產物 (圖2)。

圖2.苯甲醇化學合成方法

在前期研究中，湖北大學李愛濤教授從甲苯降解菌中鑒定了一種特殊的P450酶，命名為P450tol，它以甲苯為底物，生成專一的產物苯甲醇，這是迄今發現的唯一可以天然催化甲苯生成苯甲醇的酶。然而，P450tol三維結構信息的缺乏，限制了針對P450tol的基礎研究與未來的應用。

揭開特殊P450酶的神秘面紗

要改造高效的P450tol，必須揭開酶結構的面紗。為此，李愛濤教授與郭瑞庭教授團隊強強聯手。2020年5月，郭瑞庭教授團隊成為世界上首次解析自給自足P450酶的全長晶體結構的團隊，并獲得了廣泛的關注和贊譽。這次的強強聯手合作，一舉解開了P450tol的結構謎團。

在這項研究中，郭瑞庭、陳純琪團隊順利解析了P450tol的空結構以及與底物甲苯及產物苯甲醇的復合體結構。通過這些結構信息，精準的揭示了P450tol由甲苯通過一步反應生成苯甲醇，且反應沒有副產物生成的結構機制。

陳純琪教授介紹，P450酶的活性區都會帶一個血紅素分子參與催化反應，他們解析的P450tol也不例外。底物甲苯位于由一系列疏水的氨基酸組成的口袋中，甲苯的甲基朝向血紅素中心的鐵離子，兩個氨基酸(F329和A279)分別位于底物的兩側，牢牢鉗住了甲苯的苯環，甲苯前方還有一個氨基酸(V326)負責固定整個甲苯的位置(圖3A)，這樣催化反應發生時就可以精確的發生在芐基位，而不是其它任意的位置，如此精巧的反應也只有酶可以做到了。另外，他們在P450tol與苯甲醇的復合體結構中也看到了類似的現象，只不過苯甲醇的羥基代替甲苯的甲基朝向血紅素中心的鐵離子(圖3B)”。

此外，他們也觀察到了一個非常有意思的現象，甲苯或苯甲醇并不能將P450tol的活性區完全占據，還有一些多余的空間，所以他們猜測P450tol或許可以結合比甲苯或苯甲醇更大一些的底物。復合體結果與他們推測的一致，P450tol也可以與一些鹵代甲苯形成復合體，且可以精確的在芐基位發生羥基化反應，所有這些結果都顯示，配體會以有利于反應發生的方式結合并參與反應，這也使酶的反應更精準而高效。

        圖3. P450tol及復合體晶體結構。(A)P450tol與甲苯復合體結構及活性區關鍵氨基酸；(B)P450tol與苯甲醇復合體結構及活性區關鍵氨基酸。

人工融合酶實現苯甲醇高效綠色合成

自然界中大部分的P450酶都需要一個能夠與之匹配的還原酶來提供電子以發生催化反應，這對于后續的應用是一個難題。為了實現工業應用，尋找天然的自給自足型P450酶或者索性構建高效的自給自足型P450人工融合酶成為科研工作者關注的焦點。

“2020年5月，郭瑞庭團隊解析的自給自足型P450酶(CYP116B46)的全長晶體結構，給我們構建自給自足型人工融合酶帶來了非常大的啟發。”李愛濤教授說，他們將P450tol和CYP116B46的還原酶結構域融合構建的自給自足型人工融合酶 (圖4)不論在酶活性、穩定性、還是半衰期都獲得了很大的提升。目前，P450tol和CYP116B46的融合是世界上首例報道的穩定性和活性均大幅提升的人工融合酶，有很大的希望應用于實際的工業生產中。

圖4.自給自足型人工融合酶P450tol-CYP116B46構建。

不僅如此，P450tol-CYP116B46還可以催化丙基苯在近末端或芐基位區域選擇和立體選擇羥基化 (圖5A)，這些羥基化產物中，有些是非常重要的藥物中間體。我們也基于P450tol的三維結構，使用蛋白質工程的手段理性設計和改造，使其反應更多的朝向人類有益的方向發生(圖5B和5C)。

圖5. P450tol-CYP116B46催化丙基苯(3)羥基化反應。(A)P450tol-CYP116B46催化丙基苯生成的可能的羥基化產物((S)-或(R)-4; (S)-或(R)-5)；(B) 基于P450tol晶體結構與丙基苯分子對接及活性區關鍵氨基酸；(C)使用HPLC檢測P450tol-CYP116B46及突變體羥基化丙基苯的產物。

“在未來的研究領域，隨著結構生物學、人工智能、酶定向進化等的大力發展，通過理性設計和改造，獲得更多新的具有重要功能的酶來造福于人類，將會是一個重要的研究和發展方向，我們也將繼續致力于更多P450tol人工融合酶的構建，期待獲得更具挑戰的新反應和性能獲得極大提升的新酶。”郭瑞庭教授表示。

論文鏈接：https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acscatal.1c05845