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近日，中國(guó)農(nóng)大植物保護(hù)學(xué)院沈杰教授團(tuán)隊(duì)的呋蟲胺納米制劑研究成果引起農(nóng)藥界及社會(huì)廣泛關(guān)注。農(nóng)藥在保障我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全和國(guó)家糧食安全方面發(fā)揮著舉足輕重的作用，但其不科學(xué)的施用也給農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展、農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化推進(jìn)，乃至人類健康帶來(lái)了許多負(fù)面影響。我國(guó)農(nóng)業(yè)生態(tài)健康、鄉(xiāng)村振興和“藥肥雙減”等國(guó)家戰(zhàn)略迫切需求綠色農(nóng)藥創(chuàng)制和農(nóng)藥納米化新技術(shù)。

圖1 團(tuán)隊(duì)研究人員組成

沈杰教授團(tuán)隊(duì)長(zhǎng)期致力于納米材料在病蟲害綠色防控領(lǐng)域的應(yīng)用（圖1），借助新型功能化納米材料，建立了簡(jiǎn)便的昆蟲基因干擾新技術(shù)平臺(tái)，通過(guò)點(diǎn)滴法即可遞送dsRNA快速穿透昆蟲體壁，高效穩(wěn)定干擾基因表達(dá)；利用基因編輯、同源重組等技術(shù)構(gòu)建了大腸桿菌新菌株和新質(zhì)粒，該表達(dá)體系大幅提升了RNA的產(chǎn)率，達(dá)6倍以上；將工程菌表達(dá)的RNA與納米載體混配組裝，田間噴霧實(shí)驗(yàn)表明，其對(duì)蚜蟲等害蟲防效初步滿足生物防治需求。

同時(shí)，納米載體可以實(shí)現(xiàn)納米級(jí)藥物裝載，增強(qiáng)水溶性，實(shí)現(xiàn)納米化，增強(qiáng)農(nóng)藥的植物內(nèi)吸性及害蟲體壁的滲透能力，降低農(nóng)藥殘留水平，具有提升殺蟲效率、降低農(nóng)藥施用量的作用。

圖2 獲獎(jiǎng)證書

該團(tuán)隊(duì)的系列納米載體榮獲2021年度中國(guó)石油和化學(xué)工業(yè)聯(lián)合會(huì)科技進(jìn)步獎(jiǎng)一等獎(jiǎng)（圖2）。

RNA農(nóng)藥被譽(yù)為農(nóng)藥第三次革命，是國(guó)際上的研發(fā)和市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)熱點(diǎn)，中國(guó)農(nóng)大植物保護(hù)學(xué)院沈杰教授團(tuán)隊(duì)經(jīng)過(guò)10余年的不懈努力，系統(tǒng)闡明了納米載體提升外源植保因子生物學(xué)活性的細(xì)胞生物學(xué)機(jī)理，成功研發(fā)了可噴灑型RNA農(nóng)藥與農(nóng)藥納米化增效減施技術(shù)體系，二者的田間推廣應(yīng)用和產(chǎn)業(yè)化將大力推動(dòng)我國(guó)擁有完全自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的病蟲害綠色防控新技術(shù)和產(chǎn)品的發(fā)展，預(yù)期目標(biāo)是實(shí)現(xiàn)RNA農(nóng)藥的產(chǎn)業(yè)化、大幅提升傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥的效率、降低農(nóng)藥殘留、治理抗藥性，確保農(nóng)產(chǎn)品安全生產(chǎn)。

沈杰教授團(tuán)隊(duì)建立了簡(jiǎn)便的昆蟲基因干擾新技術(shù)平臺(tái)：點(diǎn)滴法/噴霧法應(yīng)用dsRNA+納米載體溶液，突破昆蟲體壁屏障，穩(wěn)定高效干擾基因表達(dá)。

RNA干擾技術(shù)被廣泛應(yīng)用于昆蟲基因的功能解析，為闡明昆蟲復(fù)雜生命活動(dòng)提供了一種實(shí)用的分析手段。但昆蟲的免疫系統(tǒng)會(huì)阻止外源dsRNA進(jìn)入自身細(xì)胞并將其降解，有些昆蟲的腸道和血淋巴中存在較強(qiáng)的RNA降解酶，導(dǎo)致外源dsRNA的快速降解，從一定程度上降低了基因干擾效率。一些重要的鱗翅目和半翅目農(nóng)業(yè)害蟲的RNAi效率低、穩(wěn)定性差，嚴(yán)重制約了關(guān)鍵基因的功能解析。為了突破鱗翅目、半翅目等昆蟲RNAi的技術(shù)瓶頸，團(tuán)隊(duì)建立了一種以納米材料為載體的核酸遞送平臺(tái)，合成了周圍攜帶正電荷樹枝狀大分子星聚物，作為一種陽(yáng)離子熒光聚合物，熒光納米載體可以通過(guò)靜電作用結(jié)合負(fù)電性的核酸分子，形成穩(wěn)定的復(fù)合體。該團(tuán)隊(duì)于2019年利用該熒光型納米載體首次建立了一種新型的蚜蟲dsRNA體壁遞送系統(tǒng)（圖3）。通過(guò)簡(jiǎn)便的背板點(diǎn)滴法，納米載體可以高效穿透大豆蚜體壁，進(jìn)入胚胎、脂肪體等組織細(xì)胞，靶標(biāo)基因的干擾效率最高達(dá)95.4%，有效壓低了蟲口密度。

圖3 納米載體介導(dǎo)的dsRNA體壁遞送系統(tǒng)示意圖

這項(xiàng)研究國(guó)際首創(chuàng)了一種dsRNA害蟲體壁納米遞送系統(tǒng)，突破了dsRNA的遞送瓶頸，大幅提升了dsRNA的遞送效率和RNAi效率。

考慮到田間實(shí)際應(yīng)用，該團(tuán)隊(duì)對(duì)熒光型納米載體進(jìn)行了優(yōu)化改造，成功合成了一種廉價(jià)、環(huán)保的農(nóng)田應(yīng)用型納米載體。該載體可高效保護(hù)dsRNA免受核酸酶、昆蟲血淋巴、中腸液的降解，通過(guò)激活網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞吞作用，實(shí)現(xiàn)了dsRNA的高效遞送，起到了良好的基因干擾和致死效果（圖4）。

圖4 納米載體介導(dǎo)的RNAi增效機(jī)理

在解決了dsRNA的遞送難題之后，dsRNA高額的合成成本限制了其在害蟲防控中的實(shí)際應(yīng)用。針對(duì)這一問(wèn)題，該團(tuán)隊(duì)建立了一種新型工程菌表達(dá)體系，利用基因編輯、同源重組等技術(shù)對(duì)工程菌BL21(DE3)實(shí)施rnc基因的無(wú)痕敲除，使其無(wú)法表達(dá)RNase III酶，再通過(guò)構(gòu)建帶有單T7啟動(dòng)子的RNAi干擾載體來(lái)實(shí)現(xiàn)RNA的高效表達(dá)（圖5）。新型工程菌表達(dá)體系的RNA產(chǎn)量約是L4440-HT115(DE3)工程菌表達(dá)體系的6倍。

該研究所建立的工程菌表達(dá)體系在低成本的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)了RNA的大批量生產(chǎn)，打破了L4440-HT115(DE3)這一國(guó)外研發(fā)的RNA表達(dá)體系的壟斷地位。

近期，該團(tuán)隊(duì)將桃蚜兩個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育關(guān)鍵基因構(gòu)建在同一個(gè)表達(dá)載體上，實(shí)現(xiàn)了雙靶標(biāo)基因RNA的批量生產(chǎn)，借助納米載體制備的RNA農(nóng)藥具有良好的植物內(nèi)吸性能，田間噴霧實(shí)驗(yàn)對(duì)靶標(biāo)害蟲綜合防效在60%以上，且對(duì)植物及非靶標(biāo)昆蟲安全，使得RNA制劑的田間應(yīng)用成為了可能。

圖5 工程菌高效合成hpRNA技術(shù)的建立

沈杰教授團(tuán)隊(duì)建立了一種以納米載體為助劑的新型農(nóng)藥納米化增效減施技術(shù)。

近年來(lái)，我國(guó)農(nóng)藥施用量零增長(zhǎng)行動(dòng)穩(wěn)步推進(jìn)，農(nóng)藥利用率逐步提高，但與農(nóng)業(yè)發(fā)達(dá)國(guó)家相比，我國(guó)單位面積化學(xué)農(nóng)藥用量比世界平均用量高2倍以上，農(nóng)藥利用率比歐美發(fā)達(dá)國(guó)家低10至20個(gè)百分點(diǎn)。

如何進(jìn)一步提升農(nóng)藥利用率、降低化學(xué)農(nóng)藥施用量成為了我國(guó)植保工作者的共同課題。該團(tuán)隊(duì)研發(fā)了一系列藥劑型納米載體，通過(guò)分子間互作，實(shí)現(xiàn)納米級(jí)藥物裝載，納米載體可以通過(guò)分子間范德華力、氫鍵或靜電作用結(jié)合農(nóng)藥團(tuán)粒，減小其在水溶液中的粒徑，增強(qiáng)其植物內(nèi)吸作用，提升農(nóng)藥對(duì)病蟲害的防控效果。

如農(nóng)田應(yīng)用型納米載體與蛇床子素可以通過(guò)靜電和疏水作用實(shí)現(xiàn)納米級(jí)裝載，二者的結(jié)合打破了蛇床子素自身的團(tuán)粒結(jié)構(gòu)，將其粒徑減小至17.66 nm，提升了蛇床子素對(duì)二斑葉螨、桃蚜、草莓白粉病的防效（圖6）。

圖6 納米化蛇床子素病蟲兼防示意圖

為進(jìn)一步驗(yàn)證農(nóng)田應(yīng)用型納米載體能否作為一種通用的農(nóng)藥助劑，該團(tuán)隊(duì)利用納米載體結(jié)合化學(xué)農(nóng)藥噻蟲嗪，納米載體可以通過(guò)靜電作用自發(fā)與噻蟲嗪團(tuán)粒結(jié)合，將噻蟲嗪團(tuán)粒粒徑從576 nm降至116 nm，噻蟲嗪納米制劑的植物內(nèi)吸作用增強(qiáng)了1.69-1.84倍，對(duì)桃蚜的觸殺和胃毒作用均顯著提升20%左右。

同時(shí)，納米載體可以減小植物誘抗劑殼聚糖粒徑至17.4 nm，復(fù)合體具有良好的穩(wěn)定性，通過(guò)增強(qiáng)植物細(xì)胞內(nèi)吞作用，進(jìn)而放大植物抗性反應(yīng)，顯著提升對(duì)田間馬鈴薯晚疫病的防效；納米載體還可以大幅提升植物源殺菌劑丁子香酚對(duì)田間馬鈴薯晚疫病的防效（圖7）。

該藥劑型納米載體成本低廉、環(huán)境安全，可以作為一種通用的農(nóng)藥助劑，具有良好的田間應(yīng)用前景。

圖7 納米載體實(shí)現(xiàn)殼聚糖納米化并放大植物防御反應(yīng)

為田間大規(guī)模應(yīng)用做準(zhǔn)備，該團(tuán)隊(duì)系統(tǒng)評(píng)估了納米載體對(duì)天敵異色瓢蟲的生物毒性，結(jié)果表明，納米載體觸殺和胃毒急性毒力的LC50分別為43.96和19.85 mg/mL，胃毒作用的LC50是納米載體田間工作濃度的9925倍，表明納米載體相對(duì)安全。在極高濃度下，納米載體的使用主要擾亂了昆蟲細(xì)胞膜上基因的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞膜穿孔，細(xì)胞破碎，細(xì)胞液外流，引起細(xì)菌性感染，最終導(dǎo)致昆蟲的死亡。

藥劑納米化增效減施技術(shù)的應(yīng)用可以減少化學(xué)/植物源藥劑的施用，進(jìn)而降低對(duì)天敵的殺傷，在釋放異色瓢蟲卵卡的同時(shí)噴施納米化化學(xué)/植物源藥劑，既保證天敵的安全性，又解決天敵防控的滯后性問(wèn)題，兼顧速效性和持效性，具有良好的害蟲防控效果。

參考資料：http://news.cau.edu.cn/art/2022/1/24/art_8769_809991.html