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對生物活性分子進行成像能夠幫助我們理解其結構的多樣性及其發揮生理活性的結構基礎。在亞納米分辨率下通過冷凍電鏡技術對蛋白質進行成像已經為人們對蛋白質的理解提供了關鍵的結構信息。但與結構呈嚴格線性的蛋白質及核酸不同，寡糖與多糖中的單糖具有多個鏈接位點，且每個位點都存在α及β異構體。隨著技術手段日新月異，離子遷移質譜與冷凍紅外光譜技術極大地促進了寡糖及多糖的分析，但這些分析手段都是基于分子系綜的平均態，無法對單個分子進行分析，而通過隧道掃描顯微鏡技術(scanning tunnelling microscopy, STM)可以實現對單一分子的精準成像，最近，德國馬克思-普朗克固體研究所與馬克思-普朗克膠體與界面研究所的K. Kern教授，P. H. Seeberger教授與S. Rauschenbach教授開創性地利用STM實現了對不同連接的直鏈與支鏈寡糖及多糖的精準成像，并對其連接與構象進行了分析，為糖組學及糖密碼的研究奠定了堅實基礎，相關成果發表在Nature（DOI: 10.1038/s41586-020-2362-1）上。

由于可靠的STM實驗需要嚴格控制環境為超高真空(ultrahigh vacuum, UHV)以減少表面雜質的影響，因此，用于分析的糖苷樣品需要通過電噴霧離子束沉積技術(ES-IBD)制備。將ES-IBD技術與STM技術結合以進行分子成像已被廣泛應用于包括染料、多肽、蛋白以及二糖等多種非揮發物質的分析。氣態的分子離子束糖苷隨后在飛行時間質譜檢測器監測下通過核質比分選器純化以進行成像(Fig.1a)。該方法的顯著優勢在于其樣品需求量少，僅需要數微克就可以完成樣品的制備及分析。作者通過自動合成儀合成了一系列結構明確的寡糖及多糖，并在低能電子束(5 eV)下對其進行軟沉積，該溫和過程可以保證糖苷鍵不被破壞，隨后通過分子碰撞，糖苷的構型得以實現重組分配。在本實驗中，作者在低溫條件下限制分子運動，得到了在界面上均勻分布的單一分子，因此，作者可以通過STM對分子進行進一步觀察。

(圖片來源：Nature)

作者首先對在還原端連有烷氨基linker的線性α-1,6-甘露五糖，α-1,6-甘露六糖以及β-1,6-葡萄六糖進行了分析(Fig.1b, e, h)。在STM成像圖中，不同的糖苷在不同構象下具有相近的長度。低溫條件下，分子熱運動被消除，因此分子被固定在不同構象中。每個寡糖中的單糖單元以突起的形式被呈現：甘露五糖中包含5個特征突起而甘露和葡萄六糖中包含6個特征突起，突起高度在0.15 nm到0.25 nm之間變化，而且每個突起清晰地被分隔開。對所有1,6-連接的寡糖，單糖之間的距離為0.52 ± 0.07 nm，與糖的構型無關，烷氨基linker在圖像中呈現為低突起。由于這些數值與二糖的STM圖像相符，作者將這些數值用作進一步研究糖苷鍵的標準指數。

為驗證STM圖像是否能區分寡糖的連接方式，作者隨后設計了支鏈甘露六糖4和5，其中，六糖4中R2和R3殘基分別綴有兩個單糖殘基，而六糖5中僅在R2殘基上綴有一個二糖殘基。通過對其進行STM成像(Fig. 2)，作者發現STM圖像清晰地展現出了分支結構，六糖4的STM圖像中，兩個支鏈分布在主鏈兩側呈接近90度分布，其中α-1,6糖苷鍵的長度為0.53 ± 0.05 nm，與此前觀察一致，而α-1,2糖苷鍵明顯增長，為0.61 ± 0.02 nm，這種長度差異使得六糖中的每個單元均能被識別，同時表明主鏈發生了輕微扭曲。而寡糖5形狀更加緊湊，這是由于5具有更大的柔韌性，盡管軟沉積可以排除污染，但含較長支鏈的結構更易發生折疊掩蓋成像，在STM圖像中，各個單分子圖像中的突起數量明顯減少，增加了分析難度。因此，作者僅選取了含正確突起數量的分子圖像進行分析(Fig.2e)，在圖像中，該分子構象充分伸展，可以清晰地辨別分支點，通過對烷氨基linker進行定位后，該分子中每個單糖殘基均可被識別。

(圖片來源：Nature)

該方法同樣適用與具有更大聚合度多糖的精準成像(Fig.3)。具有三分支結構的十一糖的STM圖像表明所有的分支彼此分離，而且多糖中的每一個單糖單元都是可見的，因此，多糖中的三個臂可以通過其包含的甘露糖殘基數辨別。α-1,3和α-1,2糖苷鍵的長度不同，可用于區分D2和D3臂，進而可以確定殼寡糖分支。該分子高度較其他分子而言更高，可能是三個支鏈空間相互作用的結果。

(圖片來源：Nature)

該方法的另一個優勢在于可以使用ES-IBD技術從寡糖混合物中分選出含特定質量的寡糖(Fig.4)，比如，通過對核質比四級桿分選器進行調整可以實現甘露五糖和甘露六糖的準確分離，隨后可以對兩種寡糖分別進行成像分析。

(圖片來源：Nature)

總結：德國馬克思-普朗克固體研究所的K. Kern教授、S. Rauschenbach教授與馬克思-普朗克膠體與界面研究所的P. H. Seeberger教授共同合作利用STM對多種寡糖及多糖進行了成像分析，為研究聚糖的拓撲，結構和功能提供了化學選擇性的方法。在低溫條件下以亞納米級分辨率以可視化手段研究固定構象的單一糖苷分子，可防止由于構象平均化而導致的信息丟失。經過質量分選確保觀察到的幾何形狀和拓撲結構可以明確地與結構特征相關。在單分子水平上化學選擇地獲得寡糖的結構信息將為進一步認識糖類化合物的結構奠定基礎，在破譯糖代碼的道路上邁出堅實的一步。

撰稿人：H.D.