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復旦大學黎占亭團隊JACS：可以包合并傳遞蛋白質(zhì)的水溶性柔性有機框架

來源：化學加（ID：tryingchem）      2020-03-18
導讀：近日，復旦大學黎占亭教授、周偉副教授、張運昌團隊以半剛性四陽離子四醛和四個柔性二酰肼為原料，合成了四種水溶性腙基三維柔性有機框架FOF-1-4。1H NMR譜圖顯示了重水中FOF-1-4的形成，動態(tài)光散射實驗表明，這些多孔骨架的水動力直徑在50-120 nm之間，隨濃度的變化而變化。新的水溶性骨架具有較低的細胞毒性，并形成直徑為5.3或6.7 nm的固有孔隙，使牛血清白蛋白、綠色和橙色熒光蛋白等蛋白質(zhì)能夠快速包合，并能有效地將蛋白質(zhì)輸送到正常細胞和癌細胞中，所輸送的細胞百分率高達99.8 %。（DOI：10.1021/jacs.9b13263）
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多孔聚合物在分離、催化、包合和輸送等方面具有巨大應用潛力，且三維聚合物由于其固有的網(wǎng)絡化傾向，在結(jié)構(gòu)上是多孔材料設計的理想材料。自20世紀40年代Flory開創(chuàng)性的理論研究以來，許多三維聚合物是由柔性單體制備的，具有固有納米級孔的水溶性三維聚合物是DNA和蛋白質(zhì)等生物大分子包合和傳遞的理想材料。然而，這類聚合物的設計和合成仍然是一個不發(fā)達的領域。動態(tài)共價化學為熱力學控制的大分子和超分子靶的合成提供了堅實的基礎。迄今為止，利用這一策略制備多孔聚合物的嘗試主要集中在溶劑熱條件下晶體共價有機骨架的構(gòu)建上，具有納米尺度孔的水溶性聚合物框架用于有效的客體封裝尚未報告。作者通過平衡分子組分的剛性和柔性，在水中定量形成腙鍵，合成一種新的柔性有機框架，并證明這種新型水溶性框架具有良好的生物相容性，可以原位包裹蛋白質(zhì)并進行有效的細胞內(nèi)傳遞。
在水溶液中，肼和醛反應生成腙，作者利用多元原理將其定量化，制備了水溶性、半剛性的四醛T1和柔性的雙酰肼L1-L4，并研究了它們的反應，制備了腙基三維聚合物。通過保持1:2的化學計量比，作者首次在重水中使用1H核磁共振波譜對反應進行了研究。在[T1]=2.4 mM時，反應在鹽酸催化下在室溫下定量進行，觀察到在9.9 ppm下O=CH信號在約30分鐘后完全消失。所有產(chǎn)物的1H核磁共振譜寬，暗示了氫化聚合物的形成。作者將這一新的聚合物家族稱為柔性有機框架（FOF-1-4），因為它們是由柔性構(gòu)建塊通過動態(tài)的腙鍵合成的，并保持了固有的納米級孔隙。將溫度升高到90 °C導致FOF-1的1H NMR譜中出現(xiàn)弱CHO峰，這表明腙鍵部分水解。然而，當冷卻到室溫時，這個信號消失，這表明醛轉(zhuǎn)變回腙。由T1和L1反應制備的FOF-1的1H NMR譜與通過稀釋更濃的溶液獲得的相同濃度溶液的1H NMR譜幾乎相同，很好地反映了腙鍵的動力學特征。將濃度降低至0.6 mM不會產(chǎn)生任何CHO信號，表明在稀釋溶液中腙鍵保持完整。進一步的1H NMR譜研究表明，在達到平衡后，對照化合物4-（4-芐基吡啶-4yl）苯甲醛（M1，9.6 mm）和L1（4.8 mm）的反應以88%的產(chǎn)率發(fā)生形成腙鍵。FOF-1-4的紅外光譜表明，以1703 cm-1為中心的T1的醛C=O鍵的伸縮振動完全消失，與腙鍵的定量形成一致。
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圖1. 水溶液中T1和L1-L4縮合反應合成腙基柔性有機骨架FOF-1-4。(圖片來源：J. Am. Chem. Soc. )
FOF-1-4溶液的DLS曲線顯示，在[T1]=2.4 mM時，溶液的水動力直徑（DH）分別為122、91、122和106 nm。溶液靜置3個月后得到類似的結(jié)果，這表明了均質(zhì)框架的高穩(wěn)定性。相比之下，T1在2.4 mM的溶液中DH值要小得多，約為10 nm，這反映了疏水性4-苯基吡啶單元的分子間堆積。骨架的DH值隨濃度的降低而降低，然而即使在[T1]=0.1 mM時，溶液的DH仍在12到38 nm之間。為了研究pH值對骨架DH變化的影響，作者用NaOH將上述FOF-1溶液調(diào)節(jié)至pH=7.3，然后稀釋至[T1]=0.1 mm。將稀釋溶液靜置24小時，然后進行DLS測量，測量的DH為91 nm。顯然，在弱堿性介質(zhì)中，動態(tài)聚合物中的腙鍵交換變得非常緩慢，這對于蛋白質(zhì)的包封和傳遞至關(guān)重要。pH=7時，FOF-1-4的ζ電位分別為46.2、25.3、23.9和38.6 mV，這表明所有的框架表面都帶正電。 
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圖2. pH=4.5時25 °C水中不同濃度的FOF-1和T1的DLS。(圖片來源：J. Am. Chem. Soc. )
分子模擬研究表明，T1的醛基不能與L1-L4縮合形成簡單的1+1大環(huán)。通過假設理想的縮合過程和所有脂肪族鏈采用完全伸展構(gòu)象，FOF-1-4將形成一個動態(tài)的三維菱形框架。通過兩種組分的6+6縮合形成的環(huán)己烷樣孔的孔徑計算，FOF-1約為5.3 nm，FOF-2-4約為6.7 nm。為了測試這些動態(tài)共價聚合物是否形成固有孔，作者進行了客體包裹體研究。采用減壓蒸發(fā)法制備了FOF-1和FOF-4粉末。干燥后將粉末置于寬度為2.3 nm的剛性4,4′,4″,4′″-卟啉-5,10,15,20-四苯甲酸鹽（PTB，作為鈉鹽）溶液中，并使用紫外可見光譜跟蹤客體吸附。向PTB水溶液（0.25 mM，3 mL）中加入兩種粉末1.1、2.2、4.4或6.6 mg，通過記錄吸附前后PTB的吸光度，我們確定61 %、71 %、88 %和100 %的PTB被FOF-1吸附，66 %、75 %、90 %和100 %的PTB被FOF-4吸附。這一事實支持了骨架不是僅僅吸附在表面，而是形成了包含卟啉客體的固有孔隙。
然后，作者使用細胞計數(shù)試劑盒-8（CCK-8）分析，用ana-1、hepg2、lovo和skov3細胞系評估FOF-1-4的細胞毒性。在30 μg的濃度下，所有16個被測細胞系的存活率均保持在85 %以上。在60 μg濃度下，15株細胞系仍保持75 %的存活率，其中1例存活率為71.5 %。這些初步結(jié)果表明，框架的細胞毒性相當?shù)汀?/span>
BSA、GFP和OFP這三種蛋白質(zhì)均產(chǎn)生負的ζ電位，而它們與框架的混合物均表現(xiàn)出4.9-25.8 mV的正ζ電位。這些觀察結(jié)果支持了框架和蛋白質(zhì)之間的強相互作用，這種作用可能通過簡單的表面到表面的接觸或框架對蛋白質(zhì)的包合而發(fā)生。由于共焦激光顯微鏡成像和流式細胞儀實驗顯示，該框架具有良好的細胞傳遞蛋白質(zhì)的能力，因此有理由認為該蛋白質(zhì)包含在框架內(nèi)。三種蛋白質(zhì)的溶液在沒有和存在框架FOF-1和FOF-4的情況下表現(xiàn)出非常相似的圓二色性信號，這表明框架中包含的蛋白質(zhì)保持其二級和三級結(jié)構(gòu)。
在ana-1細胞系中追蹤溶酶體，用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色細胞核，研究FITC-BSA的傳遞。FITC-BSA和FOF-1-4孵育16h后，用共焦激光掃描顯微鏡對細胞進行觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，四個樣品的FITC標記熒光信號都非常清晰，用Lyso追蹤溶酶體和DAPI染色細胞核的熒光信號高度重疊。在沒有框架的情況下，沒有觀察到游離FITC-BSA的FITC標記的熒光。這些觀察清楚地支持了所有四個框架都將BSA導入ana-1細胞。進一步的CLSM實驗表明，這四個框架還可以實現(xiàn)GFP或OFP向ana-1細胞的傳遞。
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圖3. 存在或不存在FOF-1-4時，用FITC-BSA孵育16 h后ana-1細胞的共焦激光顯微圖像。(圖片來源：J. Am. Chem. Soc. )
進一步研究FOF-1-4向ana-1細胞內(nèi)傳遞FITC-BSA、GFP和OFP的過程。對于FITC-BSA，四個框架都表現(xiàn)出良好的交付能力。轉(zhuǎn)染細胞百分比（PTC）在75.0-92.2 %之間。如果沒有框架，FITC-BSA自身的PTC為2.0 %。1:2的重量比代表了FITC-BSA框架的大量負載。當FOF-1的量減少到1:1的重量比時，仍然可以實現(xiàn)64.0 %的PTC。然而沒有這些框架，兩種蛋白都不能顯著地轉(zhuǎn)染細胞， PTC低至1.8 %或3.7 %。其中，FOF-1的運力最大。利用流式細胞術(shù)進一步評估FOF-1-4對FITC-BSA向skov3、hegp2和lovo癌細胞的轉(zhuǎn)運能力。對于skov3細胞系，所有的骨架均表現(xiàn)出較高的傳遞效率，PTC為95.4-99.8 %。對于lovo細胞系，FOF-1、FOF2和FOF-4表現(xiàn)出良好的傳遞能力，PTC在83.7 %到93.0 %之間，而FOF-3 PTC=65.2 %。對于hepg2細胞系，框架的傳遞能力普遍降低。然而，FOF-1和FOF-4仍分別實現(xiàn)了84.4 %和82.3 %的PTC。
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圖4.（a）FITC-BSA、GFP和OFP經(jīng)C1或FOF-1-4（進入ana-1細胞系的遞送實驗，以及（b）FITC-BSA經(jīng)C1或FOF-1-4在37℃下孵育16小時后進入skov3、hepg2和lovo癌細胞系的遞送實驗。(圖片來源：J. Am. Chem. Soc. )
總結(jié)：在這項研究中，黎占亭團隊證明可以通過從容易獲得的陽離子和親水性前體形成動態(tài)的腙鍵來制備具有納米級孔的水溶性柔性有機框架。所得到的共價聚合物的固有孔隙率是通過引入剛性四苯甲烷載體實現(xiàn)的，而由四元單體誘導的多價性允許定量形成腙鍵，從而形成尺寸超過100 nm的多孔骨架。柔性聚合物框架的大孔既有離子結(jié)構(gòu)域，也有疏水結(jié)構(gòu)域，可包合不同的蛋白質(zhì)，以實現(xiàn)高效的細胞內(nèi)傳遞。柔性多孔有機框架是新興晶體共價有機框架的獨特擴展，其水溶性和穩(wěn)定性好、納米尺寸可控、易于制備等特點為其作為生物相容性軟材料的應用打開了大門。

撰稿人：馮虹


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