欧美色盟,色婷婷AV一区二区三区之红樱桃,亚洲精品无码一区二区三区网雨,中国精品视频一区二区三区

近日，山西大學(xué)分子科學(xué)研究所陰彩霞教授課題組合成了探針Ly-NT-SP，用于溶酶體中SO₂的檢測(cè)。探針Ly-NT-SP在pH 5.0的PBS溶液中在535 nm有明顯的熒光發(fā)射。紫外光照射后，Ly-NT-SP中的螺吡喃基團(tuán)異構(gòu)化為半花菁形式（Ly-NT-MR），其熒光發(fā)射峰紅移至630 nm。此外，光控的Ly-NT-SP到Ly-NT-MR的異構(gòu)化反應(yīng)生成了一個(gè)C=C-C=N⁺基團(tuán)，該基團(tuán)能夠與SO₂發(fā)生Michael加成反應(yīng)，加成產(chǎn)物在535 nm處具有明顯的熒光發(fā)射。體外研究表明，光活化Ly-NT-MR對(duì)SO₂具有顯著的選擇性，檢出限為4.7 μM。該探針首次成功地應(yīng)用于熱休克過(guò)程中溶酶體內(nèi)SO₂濃度變化監(jiān)測(cè)。（DOI:10.1021/jacs.9b13936）

紫外光照射后，螺吡喃（SP）的結(jié)構(gòu)可以可逆地轉(zhuǎn)變?yōu)?/span>半花菁（MR）態(tài)。由于萘酰亞胺給體與MR受體之間存在共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）過(guò)程，可以觀察到綠色熒光到紅色熒光的“紅移”熒光響應(yīng)。特別是紫外激活的MR態(tài)包含一個(gè)特殊的碳碳雙鍵，該雙鍵可受到SO₂的原位進(jìn)攻。這種原位紫外激活策略使作者能夠以比率測(cè)量的方式準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)溶酶體中的SO₂，這在很大程度上避免了探針在細(xì)胞中假陽(yáng)性信號(hào)的干擾。

圖1. Ly-NT-SP的分子設(shè)計(jì)，SO₂的傳感機(jī)制以及在紫外輻射控制下的原位反應(yīng)示意圖。(圖片來(lái)源：J. Am. Chem. Soc. )

探針Ly-NT-SP在PBS溶液中的熒光發(fā)射在535 nm處。作者發(fā)現(xiàn)，紫外照射120 s之后，探針熒光光譜中535 nm處的最大發(fā)射紅移到630 nm。紫外吸收光譜中，隨著紫外光照射時(shí)間的增加，探針在540 nm處出現(xiàn)一個(gè)新的吸收峰。以上光譜變化表明紫外光控制探針由Ly-NT-SP向Ly-NT-MR的轉(zhuǎn)變是有效的，同時(shí)該轉(zhuǎn)化過(guò)程伴隨著由萘酰亞胺熒光團(tuán)到半花菁熒光團(tuán)熒光共振能力轉(zhuǎn)移過(guò)程。隨后作者測(cè)試了探針Ly-NT-MR在SO₂存在下的熒光光譜和紫外可見(jiàn)吸收光譜變化。加入Na₂SO₃（作為SO₂供體）后，在熒光光譜中，探針630 nm處的發(fā)射帶向前移動(dòng)至535 nm；紫外吸收光譜中，540 nm處的Ly-NT-MR吸收帶隨之逐漸減小。

 圖2. 探針Ly-NT-SP用紫外光照射120 s以及加入Na₂SO₃后的光譜圖。(圖片來(lái)源：J. Am. Chem. Soc. )

MTT法測(cè)試探針結(jié)果表明探針（10 μM）對(duì)HeLa細(xì)胞無(wú)明顯毒副作用。之后在紫外線照射不同時(shí)間條件下檢測(cè)細(xì)胞活力，發(fā)現(xiàn)紫外線照射過(guò)程的光毒性低。然后作者在HeLa細(xì)胞中檢測(cè)了Ly-NT-SP的細(xì)胞內(nèi)光控方式。HeLa細(xì)胞在37 ℃下與Ly-NT-SP孵育20分鐘，再用紫外光和可見(jiàn)光連續(xù)照射。Ly-NT-SP處理的HeLa細(xì)胞在綠色通道中顯示出明顯的綠色熒光。然而紫外線照射后，綠色通道的熒光消失，紅色通道出現(xiàn)明顯的紅色發(fā)射，這是由于非活性Ly-NT-SP轉(zhuǎn)化為SO₂活性的Ly-NT-MR的結(jié)果。然后，在可見(jiàn)光照射下，觀察到綠色熒光明顯增強(qiáng)，紅色通道減少。這些結(jié)果清楚地驗(yàn)證了探針Ly-NT-SP對(duì)細(xì)胞內(nèi)光致變色作用的光控策略。

 圖3. 用Ly-NT-SP孵育細(xì)胞的共聚焦顯微鏡圖像。(圖片來(lái)源：J. Am. Chem. Soc. )

此外，作者還研究了探針Ly-NT-SP對(duì)活細(xì)胞中外源和內(nèi)源SO₂檢測(cè)的檢測(cè)性能。用Ly-NT-SP預(yù)處理HeLa細(xì)胞15分鐘，然后用紫外線照射2分鐘。在紅色通道中觀察到強(qiáng)烈的紅色熒光。外源SO₂（Na₂SO₃）加入后，綠色通道中的熒光信號(hào)隨著紅色通道中熒光信號(hào)的降低而顯著增加。為了評(píng)價(jià)Ly-NT-SP對(duì)內(nèi)源性SO₂的檢測(cè)能力，用1 μg/mL脂多糖（LPS）預(yù)處理HeLa細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生低水平的內(nèi)源性亞硫酸鹽。與用Ly-NT-SP處理和紫外光照射的細(xì)胞相比，脂多糖預(yù)處理的HeLa細(xì)胞顯示出較強(qiáng)的綠色熒光，同時(shí)伴有相對(duì)較弱的紅色熒光。綜上所述，探針Ly-NT-SP能夠同時(shí)跟蹤活細(xì)胞中的外源和內(nèi)源SO₂濃度變化。

 圖4. 外源性Na₂SO₃和內(nèi)源性Na₂SO₃（脂多糖預(yù)處理）對(duì)Ly-NT-MR的共聚焦顯微鏡成像。(圖片來(lái)源：J. Am. Chem. Soc. )

接下來(lái)，作者測(cè)試了熱休克情況下探針Ly-NT-SP 在HeLa細(xì)胞內(nèi)對(duì)SO₂濃度變化的成像能力。HeLa細(xì)胞首先與Ly-NT-SP在37 ℃下孵育20分鐘，然后用紫外光照射。之后再將細(xì)胞在37、39、41和43 ℃下進(jìn)一步孵育30分鐘，拍攝共焦顯微鏡圖像。當(dāng)溫度升高時(shí)，紅色熒光通道熒光信號(hào)明顯降低，而在綠色通道中，觀察到熒光增強(qiáng)。綠色與紅色的發(fā)射比隨著溫度的升高而增加。而在細(xì)胞孵育SO₂抑制劑甲醛以后，發(fā)現(xiàn)綠色與紅色熒光發(fā)射比值未發(fā)生明顯變化。以上結(jié)果表明，熱休克過(guò)程導(dǎo)致了溶酶體內(nèi)SO₂濃度升高。此外，未孵育NAC組細(xì)胞與孵育NAC組細(xì)胞相比，綠色與紅色熒光發(fā)射比值降低，可能的原因是NAC作為抗氧化劑抑制了細(xì)胞內(nèi)SO₂的增加。

圖5. 不同溫度下，對(duì)HeLa細(xì)胞進(jìn)行紫外照射后的共聚焦顯微鏡觀察。(圖片來(lái)源：J. Am. Chem. Soc. )

作者進(jìn)一步研究了SO₂在熱休克小鼠體內(nèi)的抗氧化作用。將6-8周齡的雄性小鼠隨機(jī)分為5個(gè)實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組、HS組、HS+NAC組、HS+HCHO組和HS+Na₂SO₃組。首先，在腸道組織中驗(yàn)證了紫外輻射將Ly-NT-SP轉(zhuǎn)化為Ly-NT-MR的作用。與Ly-NT-SP孵育的回腸切片在紅色通道中顯示出輕微的紅色發(fā)射。然后在暗室中用紫外線照射組織100秒，觀察到紅色通道中的紅色熒光明顯增強(qiáng)，綠色熒光同時(shí)減弱。這些結(jié)果表明，紫外光可以在組織水平將探針Ly-NT-SP轉(zhuǎn)化為Ly-NT-MR。然后，HS組預(yù)處理回腸切片在37 ℃下與Ly-NT-SP孵育30分鐘，并暴露在紫外線下3分鐘，然后在37 ℃下再培養(yǎng)30分鐘。與對(duì)照組相比，在HS處理的腸組織中，發(fā)現(xiàn)紅色通道信號(hào)明顯減少，綠色熒光信號(hào)增加。與對(duì)照組相比，HS處理小鼠的綠色和紅色熒光比值增加了4.1倍。對(duì)于用Na₂SO₃處理的小鼠，獲得的組織成像在綠色通道顯示出顯著的熒光增強(qiáng)，而紅色通道的圖像顯示出很弱的熒光信號(hào)。此外，與對(duì)照組相比，注射Na₂SO₃引發(fā)的最明顯的熒光比變化高達(dá)4.6倍。這些結(jié)果表明，熱應(yīng)激引起小鼠小腸SO₂的上調(diào)，這證實(shí)了Ly-NT-SP對(duì)SO₂精確成像的優(yōu)勢(shì)。除此之外，在Na₂SO₃和NAC預(yù)處理小鼠中觀察到熱應(yīng)激引起的腸道損傷減少。這些結(jié)果表明，增加的SO₂可以通過(guò)抵御過(guò)量生成的ROS，在很大程度上減輕中暑引起的腸道損傷。

 圖6. HS預(yù)處理腸道組織中SO₂的共聚焦顯微鏡圖像。 (圖片來(lái)源：J. Am. Chem. Soc. )

總結(jié)：山西大學(xué)陰彩霞課題組成功地開(kāi)發(fā)了一種光激活型熒光探針，用于評(píng)估溶酶體中SO₂濃度的變化。Ly-NT-SP探針顯示了良好的溶酶體靶向性，能夠在紫外光照射下實(shí)現(xiàn)對(duì)SO₂進(jìn)行精確檢測(cè)。Ly-NT-SP也被成功地用于HeLa細(xì)胞中外源和內(nèi)源SO₂的可視化成像。此外，Ly-NT-SP首次用于跟蹤熱休克期間溶酶體SO₂的變化。研究結(jié)果表明內(nèi)源性增加的SO₂在調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化應(yīng)激中起重要作用，此外，增加的SO₂可保護(hù)小腸免受熱應(yīng)激引起的損傷。 

撰稿人：馮