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近日，山西大學分子科學研究所陰彩霞教授課題組合成了探針Ly-NT-SP，用于溶酶體中SO₂的檢測。探針Ly-NT-SP在pH 5.0的PBS溶液中在535 nm有明顯的熒光發射。紫外光照射后，Ly-NT-SP中的螺吡喃基團異構化為半花菁形式（Ly-NT-MR），其熒光發射峰紅移至630 nm。此外，光控的Ly-NT-SP到Ly-NT-MR的異構化反應生成了一個C=C-C=N⁺基團，該基團能夠與SO₂發生Michael加成反應，加成產物在535 nm處具有明顯的熒光發射。體外研究表明，光活化Ly-NT-MR對SO₂具有顯著的選擇性，檢出限為4.7 μM。該探針首次成功地應用于熱休克過程中溶酶體內SO₂濃度變化監測。（DOI:10.1021/jacs.9b13936）

紫外光照射后，螺吡喃（SP）的結構可以可逆地轉變為半花菁（MR）態。由于萘酰亞胺給體與MR受體之間存在共振能量轉移（FRET）過程，可以觀察到綠色熒光到紅色熒光的“紅移”熒光響應。特別是紫外激活的MR態包含一個特殊的碳碳雙鍵，該雙鍵可受到SO₂的原位進攻。這種原位紫外激活策略使作者能夠以比率測量的方式準確監測溶酶體中的SO₂，這在很大程度上避免了探針在細胞中假陽性信號的干擾。

圖1. Ly-NT-SP的分子設計，SO₂的傳感機制以及在紫外輻射控制下的原位反應示意圖。(圖片來源：J. Am. Chem. Soc. )

探針Ly-NT-SP在PBS溶液中的熒光發射在535 nm處。作者發現，紫外照射120 s之后，探針熒光光譜中535 nm處的最大發射紅移到630 nm。紫外吸收光譜中，隨著紫外光照射時間的增加，探針在540 nm處出現一個新的吸收峰。以上光譜變化表明紫外光控制探針由Ly-NT-SP向Ly-NT-MR的轉變是有效的，同時該轉化過程伴隨著由萘酰亞胺熒光團到半花菁熒光團熒光共振能力轉移過程。隨后作者測試了探針Ly-NT-MR在SO₂存在下的熒光光譜和紫外可見吸收光譜變化。加入Na₂SO₃（作為SO₂供體）后，在熒光光譜中，探針630 nm處的發射帶向前移動至535 nm；紫外吸收光譜中，540 nm處的Ly-NT-MR吸收帶隨之逐漸減小。

 圖2. 探針Ly-NT-SP用紫外光照射120 s以及加入Na₂SO₃后的光譜圖。(圖片來源：J. Am. Chem. Soc. )

MTT法測試探針結果表明探針（10 μM）對HeLa細胞無明顯毒副作用。之后在紫外線照射不同時間條件下檢測細胞活力，發現紫外線照射過程的光毒性低。然后作者在HeLa細胞中檢測了Ly-NT-SP的細胞內光控方式。HeLa細胞在37 ℃下與Ly-NT-SP孵育20分鐘，再用紫外光和可見光連續照射。Ly-NT-SP處理的HeLa細胞在綠色通道中顯示出明顯的綠色熒光。然而紫外線照射后，綠色通道的熒光消失，紅色通道出現明顯的紅色發射，這是由于非活性Ly-NT-SP轉化為SO₂活性的Ly-NT-MR的結果。然后，在可見光照射下，觀察到綠色熒光明顯增強，紅色通道減少。這些結果清楚地驗證了探針Ly-NT-SP對細胞內光致變色作用的光控策略。

 圖3. 用Ly-NT-SP孵育細胞的共聚焦顯微鏡圖像。(圖片來源：J. Am. Chem. Soc. )

此外，作者還研究了探針Ly-NT-SP對活細胞中外源和內源SO₂檢測的檢測性能。用Ly-NT-SP預處理HeLa細胞15分鐘，然后用紫外線照射2分鐘。在紅色通道中觀察到強烈的紅色熒光。外源SO₂（Na₂SO₃）加入后，綠色通道中的熒光信號隨著紅色通道中熒光信號的降低而顯著增加。為了評價Ly-NT-SP對內源性SO₂的檢測能力，用1 μg/mL脂多糖（LPS）預處理HeLa細胞，誘導細胞產生低水平的內源性亞硫酸鹽。與用Ly-NT-SP處理和紫外光照射的細胞相比，脂多糖預處理的HeLa細胞顯示出較強的綠色熒光，同時伴有相對較弱的紅色熒光。綜上所述，探針Ly-NT-SP能夠同時跟蹤活細胞中的外源和內源SO₂濃度變化。

 圖4. 外源性Na₂SO₃和內源性Na₂SO₃（脂多糖預處理）對Ly-NT-MR的共聚焦顯微鏡成像。(圖片來源：J. Am. Chem. Soc. )

接下來，作者測試了熱休克情況下探針Ly-NT-SP 在HeLa細胞內對SO₂濃度變化的成像能力。HeLa細胞首先與Ly-NT-SP在37 ℃下孵育20分鐘，然后用紫外光照射。之后再將細胞在37、39、41和43 ℃下進一步孵育30分鐘，拍攝共焦顯微鏡圖像。當溫度升高時，紅色熒光通道熒光信號明顯降低，而在綠色通道中，觀察到熒光增強。綠色與紅色的發射比隨著溫度的升高而增加。而在細胞孵育SO₂抑制劑甲醛以后，發現綠色與紅色熒光發射比值未發生明顯變化。以上結果表明，熱休克過程導致了溶酶體內SO₂濃度升高。此外，未孵育NAC組細胞與孵育NAC組細胞相比，綠色與紅色熒光發射比值降低，可能的原因是NAC作為抗氧化劑抑制了細胞內SO₂的增加。

圖5. 不同溫度下，對HeLa細胞進行紫外照射后的共聚焦顯微鏡觀察。(圖片來源：J. Am. Chem. Soc. )

作者進一步研究了SO₂在熱休克小鼠體內的抗氧化作用。將6-8周齡的雄性小鼠隨機分為5個實驗組，對照組、HS組、HS+NAC組、HS+HCHO組和HS+Na₂SO₃組。首先，在腸道組織中驗證了紫外輻射將Ly-NT-SP轉化為Ly-NT-MR的作用。與Ly-NT-SP孵育的回腸切片在紅色通道中顯示出輕微的紅色發射。然后在暗室中用紫外線照射組織100秒，觀察到紅色通道中的紅色熒光明顯增強，綠色熒光同時減弱。這些結果表明，紫外光可以在組織水平將探針Ly-NT-SP轉化為Ly-NT-MR。然后，HS組預處理回腸切片在37 ℃下與Ly-NT-SP孵育30分鐘，并暴露在紫外線下3分鐘，然后在37 ℃下再培養30分鐘。與對照組相比，在HS處理的腸組織中，發現紅色通道信號明顯減少，綠色熒光信號增加。與對照組相比，HS處理小鼠的綠色和紅色熒光比值增加了4.1倍。對于用Na₂SO₃處理的小鼠，獲得的組織成像在綠色通道顯示出顯著的熒光增強，而紅色通道的圖像顯示出很弱的熒光信號。此外，與對照組相比，注射Na₂SO₃引發的最明顯的熒光比變化高達4.6倍。這些結果表明，熱應激引起小鼠小腸SO₂的上調，這證實了Ly-NT-SP對SO₂精確成像的優勢。除此之外，在Na₂SO₃和NAC預處理小鼠中觀察到熱應激引起的腸道損傷減少。這些結果表明，增加的SO₂可以通過抵御過量生成的ROS，在很大程度上減輕中暑引起的腸道損傷。

 圖6. HS預處理腸道組織中SO₂的共聚焦顯微鏡圖像。 (圖片來源：J. Am. Chem. Soc. )

總結：山西大學陰彩霞課題組成功地開發了一種光激活型熒光探針，用于評估溶酶體中SO₂濃度的變化。Ly-NT-SP探針顯示了良好的溶酶體靶向性，能夠在紫外光照射下實現對SO₂進行精確檢測。Ly-NT-SP也被成功地用于HeLa細胞中外源和內源SO₂的可視化成像。此外，Ly-NT-SP首次用于跟蹤熱休克期間溶酶體SO₂的變化。研究結果表明內源性增加的SO₂在調節細胞氧化應激中起重要作用，此外，增加的SO₂可保護小腸免受熱應激引起的損傷。 

撰稿人：馮