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JACS：功能DNA調節的CRISPR-Cas12a感應器用于非核酸目標的即時診斷

來源：化學加（ID：tryingchem）      2019-12-23
導讀：除了其非凡的基因組編輯能力外，CRISPR-Cas系統還以其高堿基分辨率和等溫信號放大開啟了生物傳感應用的新時代。然而，目前報道的CRISPR-Cas傳感器大多只用于核酸的檢測，對非核酸目標的應用有限。近日，南京大學張晶晶教授課題組、美國伊利諾伊大學厄巴納-香檳分校陸藝教授課題組和南昌大學熊勇華教授課題組合作在J. Am. Chem. Soc.上報道了功能DNA分子調節的CRISPR-Cas12a感應器用于非核酸目標的即時診斷的新研究成果（DOI：10.1021/jacs.9b09211）。

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圖片來源：J. Am. Chem. Soc.

最近發現和發展的規律間隔成簇短回文重復序列（CRISPR）和CRISPR關聯蛋白（Cas）統稱為CRISPR-Cas系統，不僅改變了基因組編輯，也改變了包括醫學診斷在內的其他領域。例如，基于SHERLOCK (Specific High-sensitivity enzymatic Reporter UnLOCKing, 特異性高靈敏度酶促解鎖)和DETECTR (DNA Endonuclease-Targeted CRISPR Trans Reporter, DNA內切酶靶向的CRISPR反式報告檢測系統) 的核酸傳感器。在這類傳感器中CRISPR- cas12a (Cpf1)是一類與單鏈導向的CRISPR RNA (crRNA)結合的2型V-A CRISPR相關酶。據報道，CRISPR- cas12a不僅可以像許多其他CRISPR- cas系統那樣對目標DNA進行剪切，而且可以不加選擇地對目標DNA附近的任何非目標ssDNA進行剪切。這種非目標ssDNA被附帶剪切可以顯著提高DNA檢測的靈敏度。幾乎所有報道的CRISPR-Cas傳感器都是用來檢測核酸相關目標的。因此，在可激活的CRISPR傳感器的設計中仍然需要更多的策略，這些策略可以應用于核酸之外更廣泛的目標。
為了充分發揮CRISPR技術在診斷應用中的潛力，作者基于靶向響應的功能DNAs(fDNAs)設計出可激活的CRISPR-Cas感應器。之所以選擇fDNA，是因為它們被證明可以選擇性地結合多種非核酸靶標，包括有機小分子、金屬離子、蛋白質、病毒，甚至細胞，并且能從大型DNA文庫中進行體外選擇來獲得。通過將fDNA與CRISPR-Cas12a結合，作者證明了這個系統可以使用核酸配體激活的CRISPR-Cas12a來檢測和量化小的有機分子，用脫氧核酶激活的CRISPR-Cas12a來檢測金屬離子。
fDNA調節的CRISPR-Cas感應器由探針系統和報告系統兩部分組成。探針系統包含fDNA和CRISPR-Cas12a的DNA啟動子，報告系統包含crRNA預組裝的Cas12a效應分子和被熒光團和淬滅劑標記的單鏈DNA (ssDNA)熒光報告基因(ssDNA-FQ)。在非核酸靶標缺失的情況下，fDNA以高于環境溫度的解鏈溫度與DNA啟動子結合，阻止其與Cas12a-crRNA復合物結合(Locked Activator)。因此，Cas12a的側裂活性無法被激活，使得ssDNA- FQ報告基因保持完整。完整的ssDNA- FQ上淬滅劑靠近熒光團，從而導致ssDNA熒光報告基因的熒光增加可以忽略。另一方面，在非核酸靶標存在的情況下，與fDNA結合的靶標可以使fDNA/DNA啟動子的解鏈溫度降低到環境溫度以下，因此，DNA啟動子可以與fDNA雜交，成為“Open Activator”，與Cas12a結合并激活Cas12a。在這種情況下，ssDNA報告基因可以被裂解，導致熒光團與淬滅劑分離，從而產生明顯的熒光信號。
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 圖片來源：J. Am. Chem. Soc.
為了論證上述fDNA調控的CRISPR-Cas12a感應器用于檢測非核酸目標，作者首先選擇了應用最廣泛、研究最深入的腺苷5 -三磷酸腺苷(ATP)結構轉換適配體作為檢測目標。為了使基于CRISPR的ATP感應器具有良好的分析性能，作者設計了特定的ATP配體。該ATP配體能夠與啟動子雜交，有效阻斷啟動子與crRNA的結合，還能夠以結構轉換的方式有效地釋放啟動子以響應ATP目標。在ATP不存在的情況下，DNA啟動子被ATP適配體雜交所鎖定，不能結合crRNA激活Cas12a-crRNA的側鏈裂解活性。在ATP存在的情況下，ATP適配體與ATP結合導致ATP適配體構象改變，這弱化了ATP適配體與DNA啟動子雜交的能力。這使得DNA啟動子可以在開放狀態下釋放，從而觸發Cas12a-crRNA的側裂活動。隨后作者用電泳和熒光證實了適配體調控Cas12a-crRNA的激活。
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 圖片來源：J. Am. Chem. Soc.
為了確定適配體調控的CRISPR-Cas12a感應器能否定量檢測ATP，作者首先測量了不同濃度ATP在HEPES緩沖液中的熒光光譜。結果表明，熒光信號隨著ATP濃度（0.39 μM~50 μM）的增加而增強。接著，作者對適配體調節的CRISPR-Cas12a感應器的選擇性進行了研究。作者使用不同的競爭核苷酸-三磷酸類似物，如 GTP、CTP和UTP，進行了熒光分析。結果顯示類似物組沒有明顯熒光增強，而ATP組熒光增強了10倍。這表明，ATP適配體的高選擇性在適配體調控的CRISPR-Cas12a感應器中得到保留。隨后，作者利用人的血漿驗證了適配體調節的CRISPR-Cas12a感應器在實際樣品中的應用可行性，并與商業試劑對比驗證感應器的準確性和可靠性。結果顯示CRISPR-Cas12a感應器可以克服人體血漿中其它成分的干擾，可以準確，可靠的即時檢測非核酸目標。
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 圖片來源：J. Am. Chem. Soc.
受到上述用適配體調控的CRISPR-Cas12a感應器檢測ATP成功的鼓舞，作者使用商用便攜式熒光儀在人血漿樣本中進行了類似的測試。結果表明，在不同濃度的DNA啟動子的作用下，傳感器的熒光增強速度較快。此外，利用便攜式熒光儀的快速熒光動力學測量，酶解所需時間進一步縮短到5分鐘。
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 圖片來源：J. Am. Chem. Soc.
最后，為了證明fDNA調控的CRISPR-Cas12a感應器的通用性，作者將該方法從適配體擴展到DNA酶來檢測金屬離子，如Na +。為了檢測Na +，作者設計了Na +特異性DNA酶的模板鏈（NaA43S′）。NaA43S′的5′端修飾有DNA啟動子序列，其3′被生物素標記。這樣NaA43S′可以通過解鏈溫度比室溫高的18堿基對與酶鏈(NaA43E′)雜交。在缺乏Na +的情況下，模板鏈表現出最小的熒光信號，因為DNA啟動子被DNA酶鎖定。在Na +存在的情況下，NaA43S′被NaA43E′切成兩半，DNA啟動子被釋放。釋放的啟動子與Cas12a-crRNA復合物進一步結合，激活Cas12a的側裂活性，導致熒光信號的出現。結果表明，CRISPR-Cas12a感應器可以精確檢測金屬離子。
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 圖片來源：J. Am. Chem. Soc.
總結：南京大學張晶晶教授課題組、美國伊利諾伊大學厄巴納-香檳分校陸藝教授課題組和南昌大學熊勇華教授課題組合作展示了一個通用的功能DNA調節的CRISPR-Cas感應器用于定量檢測兩個非核酸目標。該設計策略可以將這個強大的CRISPR-Cas感應器系統擴展到其他目標。

撰稿人：犟子柳


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