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圖1.同時對細胞質粘滯度和羥基自由基成像示意圖

（圖片來源J. Am. Chem. Soc.）

鐵死亡是2012年發現的一種不同于經典的caspase依賴性凋亡途徑而調節細胞死亡的方式。鐵死亡依賴于鐵離子，會發生脂質過氧化。脂質過氧化物的積累是導致細胞死亡的主要原因。研究發現，鐵死亡過程中脂質過氧化與活性氧有關，但是哪種活性氧發揮關鍵作用還不清楚。羥基自由基作為活性最高的活性氧是否在鐵死亡過程中造成脂質過氧化還缺少相關研究。

細胞內粘滯度是生物活性物質擴散和信號傳遞等多種細胞過程的基本因子。細胞粘滯度的異常變化可能與某些疾病有關。此外，胞質粘滯度增加是細胞收縮和胞質濃縮導致的凋亡的重要形態學特征。由于鐵死亡在形態學上與凋亡不同，因此揭示鐵死亡是否與細胞粘滯度改變有關具有重要意義。

目前的熒光探針只能單獨檢測羥基自由基產生或細胞質粘滯度變化。這使得檢測過程復雜，也無法準確揭示羥基自由基與細胞質粘滯度在鐵死亡過程中的關系。因此，馬會民課題組開發了熒光探針(H-V)實現了對鐵死亡過程中羥基自由基和細胞質粘滯度的同時成像。

作者利用分子轉子策略和芳環羥基化設計出探針H-V。分子轉子有兩個對稱的小π-共軛。在分子轉子中，吲哚部分是電子受體，苯甲醚是電子供體，它們是通過可旋轉的乙烯基鍵形成D-π-A結構連接起來的。隨著微環境粘滯度的增加，分子內旋轉受到限制，從而抑制了非輻射過程中分子內扭轉電荷轉移，導致探針熒光增強。另一方面，芳環的羥基化被用來提高檢測?OH的選擇性，而強供給電子基（甲氧基）的加入能夠增強探針對?OH的捕獲能力，提高檢測靈敏度。此外，探針H-V中還引入了兩個磺酸鹽基團來中和正電荷。在H-V的donor-two-acceptors結構中， ?OH造成的羥基化主要發生在甲氧基的間位上，形成苯酚中間體，然后發生去質子化和電子重排,最終形成一個大π共軛系統(product 1)。從探針H-V到product 1光譜發生很大的紅移，并且有很鮮明的近紅外熒光變化，從而實現用獨立的通道檢測?OH，避免了粘滯度檢測通道的交叉信號。

圖2. H-V對粘滯度和羥基自由基響應的機理

（圖片來源J. Am. Chem. Soc.）

在探針被合成出來之后，作者首先研究了探針H-V對粘滯度的響應情況。探針H-V的紫外吸收在400 nm,而在520 nm處有微弱的熒光發射。作者以甲醇甘油體系模擬粘滯度，研究發現隨著粘滯度的增加，520 nm處的熒光顯著增強。在純甘油中的熒光比在純甲醇中的熒光增加了50倍。這表明探針H-V對粘滯度非常敏感。隨后，作者研究了探針H-V對?OH的響應情況。作者用芬頓反應提供?OH。隨著芬頓試劑的增加，在652 nm處的熒光顯著增強，最高增強了450倍。而在其他活性氧的反應中，并沒有明顯的熒光增強。這表明探針H-V對?OH有非常高的選擇性。

圖3. 探針對粘滯度和羥基自由基響應的熒光變化

（圖片來源J. Am. Chem. Soc.）

在研究了探針H-V對粘滯度和?OH的響應情況之后，作者利用探針H-V進行活細胞的?OH和細胞質粘滯度的獨立成像。有報道表明隨著培養溫度的降低，細胞質粘滯度升高。成像結果表明，綠色通道的熒光強度隨著孵育溫度的降低而增強，而紅色通道的熒光強度沒有變化。這些結果表明，H-V能特異性地成像細胞質粘滯度的變化。另一方面，?OH成像結果顯示，紅色通道的熒光強度時，綠色通道熒光強度無顯著變化。這表明，H-V適用于細胞內?OH的獨立成像。

圖4. 探針對細胞質粘滯度和羥基自由基的獨立成像

（圖片來源J. Am. Chem. Soc.）

在獨立成像的基礎上，作者研究了在鐵死亡過程中，探針H-V對細胞質粘滯度和?OH的成像。作者利用erastin誘導細胞鐵死亡，收集兩個獨立通道的熒光信號，同時監測細胞內?OH的特異性變化和粘滯度變化。隨著erastin孵育的時間增長，紅色和綠色通道的熒光強度都增強，而使用鐵死亡抑制劑（DFO，Fer-1，Lip-1）后，熒光強度受到顯著抑制。上述結果表明，鐵死亡伴隨著胞漿粘滯度增加和?OH生成。

圖5.鐵死亡中H-V對細胞質粘滯度和?OH的成像

（圖片來源J. Am. Chem. Soc.）

總結：中科院馬會民課題組用雙功能熒光探針H-V監測鐵死亡過程中細胞內?OH和粘滯度的變化，首次實現使用單一探針同時監測鐵死亡中?OH和粘滯度的變化并揭示了鐵死亡伴隨著羥基自由基產生和細胞質粘滯度增加。