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在過去的幾年里，化學發光已經成為一種很有前途的傳感和成像工具，其不需要外部光源的實時激發，因此幾乎不存在自熒光干擾，可以實現極高的信號背景比，提高體內成像的靈敏度。而γ-谷酰基轉肽酶(GGT)是一種蛋白酶，參與許多重要的生理過程，許多疾病與GGT活性異常密切相關。血清GGT活性測定是臨床血液檢測的常規方法。此外，許多惡性腫瘤也發現GGT過表達。因此，準確測量GGT活性并顯示其位置對疾病診斷和癌癥治療具有重要意義。

Shabat和Lippert等人對Schaap（一類經典的化學發光分子）的化學結構進行了合理的修飾，使其在生理條件下與感興趣的生物分子相互作用時發出強烈的化學發光。在此，作者使用修改過的Schaap開發了第一個由GGT激活的化學發光探針1，該探針可以高靈敏度和特異性檢測血清、腫瘤細胞和小鼠中的GGT活性。GGT激活的化學發光探針的總體設計如圖1所示，由一個與GGT響應可斷裂的底物氨基酸γ-Glu、一種高度自發光的丙烯基取代的苯氧基二氧乙烯發光體和一個連接物對氨基芐醇(PABA)組成。γ-Glu是一個特定的GGT底物,被廣泛應用于設計各種針對GGT的探針。丙烯基取代的苯氧基二氧乙烯具有高化學發光量子產率，可以在生理條件下于體內有明亮的黃綠色化學發光成像。使用PABA連接γ-Glu和發光體，可以有助于減小探測器的位阻，促進其與GGT的活性位點的相互作用。GGT斷裂底物氨基酸γ-Glu后，探針1轉換成中間體2。之后又經歷自發的消除過程和去質子化，以及破壞過氧化物鍵，最終產生熒光產物5，并伴有約540 nm處的發光。因此，可以通過GGT選擇性地開啟亮黃綠色的化學發光，從而檢測活細胞和老鼠體內的GGT活性。

圖1.GGT活化的化學發光探針1的化學結構以及化學轉化。（圖片來源：Anal. Chem.）

作者首先研究了探針1在GGT酶的緩沖液中對GGT的反應。探針1最初在350 nm處有微弱的紫外吸收和微弱的熒光。與GGT孵育6小時后，在約400  nm處出現一個新的吸收帶，并伴隨著約540 nm處的強熒光發射。反應液的吸收光譜和熒光光譜與化合物5相同，隨后的HPLC分析表明，探針1 (HPLC保留時間，TR = 10.4 min)幾乎完全轉化為產物5 (TR = 7.0 min)。然后作者測量了GGT孵育前后探針1的化學發光發射光譜。探針1本身無化學發光，但30 min后，在540 nm波長處觀察到明顯的化學發光，且最大發射值為540 nm。GGT誘導的化學發光率約為876倍。GGT孵育后探針的化學發光動力學曲線顯示信號迅速增加，在30 min左右達到最大值。相比之下，沒有GGT時，探針1在測量過程中幾乎沒有化學發光。這些結果表明，GGT可以有效地激活探針1，產生顯著的化學發光。

圖2. (a) 酶緩沖液中GGT孵育前(實線)和孵育后(虛線)探針1的紫外吸收(黑色)和熒光光譜(紅色)。(b)用高效液相色譜法對GGT孵育前(黑色)和孵育后(紅色)的探針1進行分析。(c) GGT孵化之前(黑色)和之后(紅色) 探針1的化學發光光譜和圖像。(d)加或不加GGT孵育后探針1的化學發光動力學特征。（圖片來源：Anal. Chem.）

在證實探針1對GGT的化學發光反應后，下一步檢測了探針檢測GGT的敏感性。不同濃度GGT孵育探針1，可以看出隨著GGT濃度的增加，化學發光圖像變亮，化學發光強度與GGT濃度呈良好的線性關系。接下來，作者測試了探針1對GGT的特異性，當探針1與其它酶或ROS孵育時，化學發光變化不大，說明探針是GGT的特異性化學發光探針。然后，作者使用探針1測定了脂多糖處理前后小鼠血清中GGT的活性（據報道，用從革蘭氏陰性菌壁中純化的內毒素脂多糖(LPS)處理小鼠，可引起感染性肝功能障礙）。用未處理的小鼠血清孵育后，探針1的平均化學發光量為599 ± 125 (RLU)，據此計算健康小鼠血清中GGT的平均活性估計為1.6 U/L。用LPS處理小鼠時，血清中GGT水平為3.8  U/L，是正常血清的2.4倍。這些結果與用于GGT的商用熒光探針AMC-Glu的測量結果一致，表明探針1用于GGT檢測的可靠性。

圖3.(a)不同濃度GGT孵育后探針1的化學發光圖像。(b)平均化學發光強度與GGT濃度的線性擬合曲線。(c)探針1對GGT的特異性響應。(d) 1號探針在血清中孵育的化學發光強度。(e)根據(d)中的化學發光強度定量血清中GGT活性。（圖片來源：Anal. Chem.）

然后用GGT過表達的OVCAR5和U87MG癌細胞與探針1孵化，顯示化學發光逐漸增強。最強信號出現在15 min,可持續45 min。在60 min時，與HUVEC細胞相比，OVCAR5和U87MG腫瘤細胞中的化學發光圖像更亮。OVCAR5和U87MG腫瘤細胞的平均化學發光強度分別是HUVEC細胞的29倍和23倍。這些結果表明探針1是有效的，可以實時檢測GGT在活細胞中的活動，從而不僅可以區分腫瘤細胞和正常細胞，也可以在不同腫瘤細胞系通過敏感的化學發光成像區分GGT水平。

圖4.(a) 活細胞與探針1孵化后實時測量的化學發光強度 (b) 細胞板的化學發光圖像。(c) OVCAR5細胞的熒光成像。（圖片來源：Anal. Chem.）

受探針1在活腫瘤細胞中檢測內源性GGT的高敏感性啟發，作者隨后研究了通過GGT活性的化學發光成像在體內和體外測定OVCAR5細胞數量的能力。不同數量的OVCAR5細胞與探針1孵化30 min，細胞數越多，亮度越大，發光強度與孔內細胞數量之間存在良好的線性關系。接下來，作者研究了在體內檢測OVCAR5細胞數量的能力。不同數量的OVCAR5細胞和探針1皮下注射到老鼠體內，30 min后獲取全身化學發光圖像。注射部位的化學發光信號隨細胞數量線性增加。說明探針1對活體小鼠中OVCAR5細胞數量的檢測也是可行的。

圖5.用探針1在體內外檢測OVCAR5腫瘤細胞，化學發光強度以及OVCAR5細胞數量的線性擬合曲線。（圖片來源：Anal. Chem.）

總結：南京大學葉德舉課題組合成了一種GGT活化的化學發光探針，并證明了其在體內外檢測GGT活性的潛力。研究表明，探針在生理條件下穩定，和GGT在水溶液中反應后在540 nm出現強化學發光，可以高敏感性和特異性測定用LPS處理過的小鼠血清中的GGT水平。且該探針在體外和活體小鼠體內都可以檢測到GGT相關的腫瘤細胞，敏感性比熒光成像有了很大的提高。在未來，該探針可以作為一種化學發光檢測手段，用于臨床血液樣本中GGT活性的檢測，以及研究活體受試者中與GGT相關的生理和病理過程。

撰稿人：馮虹