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光異構化反應由于其靈敏的感光生物學功能，被廣泛的應用于化工領域，如光學數據儲存、分子轉換。光異構反應中，以雙鍵順反異構化最為常見。共軛體系如綠色熒光蛋白(GFP)雙鍵的異構化有兩種途徑，單鍵翻轉（OBF）和鍵角扭轉（HT）（Figure 1）。OBF途徑只有τ鍵旋轉，而HT途徑相鄰的φ鍵隨著τ鍵旋轉，OBF途徑的原子軌道所需要的體積比HT途徑大。因此，OBF途徑常發生在允許自由運動的環境中，而HT途徑常發生在空間受限的環境中。

為了探尋綠色熒光蛋白(GFP)雙鍵光學異構化的途徑，作者以rsEGFP2（可逆轉換增強綠色熒光蛋白2） 為模型進行檢測。rsEGFP2具有易結晶的特點和良好的光學特性。β-桶狀折疊的rsEGFP2發光團自然條件下呈現順式構象，在488nm的激光照射下很容易異構化為反式構象，相反，在405nm的激光照射下，反式構象異構化回順式構象。rsEGFP2還有一個顯著的優點，rsEGFP2很容易被基團取代用來區分OBF和HT途徑。在野生型細胞中，rsEGFP2通過兩種途徑產生相同的反式產物。但如果取代基破壞rsEGFP2酚環的對稱性，兩種途徑就會產生不同的產物。當帶有取代基的cis rsEGFP2發生OBF途徑時，變為trans syn，發生HT途徑時，變為trans anti（Figure 2B）。通過琥珀抑制使3-氯酪氨酸替換67殘基處的酪氨酸，生成一個鄰位氯取代的酚氧色團。此變體Cl-rsEGFP2與野生型rsEGFP2有類似的光敏特性(Table S1)。

(圖片來源：J. Am. Chem. Soc.)

(圖片來源：J. Am. Chem. Soc.)

以發光團cis狀態為準，氯取代基處于anti的方向(Figure 3A)。當發光團異構化為trans，氯取代基處于syn的方向，并且Cl-rsEGFP2的兩個環不再平行（τ = 12°, φ = ?13° in cis; τ = 187°, φ = ?32° in trans  τ 為N?C=C?C1二面角，φ 為 C=C?C1?C6二面角）（Figure 2B），另外，空間構象輕微扭曲形成新的反式構象，酚羥基不再與His149形成氫鍵，而與水分子形成氫鍵。His149與Tyr146形成氫鍵(Figure 3A)。

   作者統計比較了一些Cl-rsEGFP2的晶體數據，發現一些晶體的單位尺寸大小比之前報道的小7%，眾所周知，當水進入或離開單個蛋白質之間的溶劑通道時，蛋白質晶體會膨脹或收縮。實驗操作的微小變化會導致Cl-rsEGFP2的溶劑含量變化。作者發現可通過將Cl-rsEGFP2晶體浸泡在相對濕度較低的低溫保護劑中，來控制降低Cl-rsEGFP2的晶格間距。低溫保護劑可將水從晶體中抽出，使之更緊密聚集在一起，從而得到“收縮”晶體。當Cl-rsEGFP2收縮成更緊密的晶格時，其折疊方式不變，但尾部和環路區域出現了輕微偏差。蛋白質在cis狀態下收縮晶體與膨脹晶體的內部幾何構型相同，trans狀態下收縮晶體與膨脹晶體相比空間結構明顯扭曲。有趣的是，trans狀態下收縮晶體Cl-rsEGFP2的兩個環平行，且與與His149形成氫鍵(Figure 3B)。這種現象在多個晶體中都有發現。Cl-rsEGFP2的晶體結構表明，晶格的微小重排可以改變光異構化途徑。由于順反異構化反應對介質的空間結構很敏感，膨脹晶體常以OBF途徑異構，而收縮晶體則以HT途徑異構。

(圖片來源：J. Am. Chem. Soc.)

Kao等人以Dronpa（可逆光致變色熒光蛋白）為研究對象，觀察到介質粘度增加會減慢Dronpa的光敏速率，無論是溶劑粘度還是晶體填料都會影響發光團異構化，表明發光團的異構化與蛋白質的β-桶狀折疊運動是耦合的。本文作者研究結論與其相似。Cl-rsEGFP2的結晶條件可能會干擾蛋白質的結構并引起功能后果。眾所周知，蛋白質的向外殘基和柔性環在晶體內可能相互作用引起結構改變，而蛋白質內部很少受到影響。而本文中，trans Cl-rsEGFP2的晶體結構單位體積收縮7%時，出現了明顯的結構改變，說明晶體填充的相互作用影響了trans Cl-rsEGFP2內殘基的構象。

小結：本文詳述了Cl-rsEGFP2晶體順反異構化的機理。顯然，蛋白質異構化的途徑不是蛋白質所固有的，而是取決于蛋白質在晶體中的構象。膨脹晶體常以OBF途徑異構化；單位體積收縮7%的收縮晶體常以HT途徑異構化。研究發現發光團的異構化與蛋白質的β-桶狀折疊運動是耦合的。在不同的熒光蛋白中，異構化的機制可能不一樣。研究結果表明結晶條件可能會導致蛋白質面向內的殘基結構重排。