文章提出了一種新的基于邏輯與的熒光探針(NY-Lyso)，它由嗎啉基、半花菁苷和1,8-萘二甲酰亞胺顯色團(tuán)組成，用于特異性檢測溶酶體中的亞硫酸氫鹽。該智能探針由兩個功能部件組成：NY-Lyso探針上的嗎啉基對細(xì)胞內(nèi)溶酶體(pH 4.5 - 5.5)和其他細(xì)胞器之間的pH差異產(chǎn)生敏感反應(yīng)，噻吩和花菁之間的碳碳雙鍵通過親核加成選擇性地與HSO3-反應(yīng)。
嗎啉基和半花菁苷均能通過光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(PET)和分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT)機(jī)制獨(dú)立淬滅發(fā)射，因此探針無熒光。當(dāng)同時存在SO2和H+時，探針在524 nm處表現(xiàn)出強(qiáng)烈的熒光發(fā)射。也就是說，只有當(dāng)SO2和pH同時被認(rèn)為是“輸入”時，熒光發(fā)射才會被“輸出”。值得注意的是，基于該方法的探針不僅具有高選擇性、快速響應(yīng)(小于200 s)、極低的檢測限(LOD = 20.7 nM)和優(yōu)良的溶酶體靶向性的優(yōu)點(diǎn)，而且克服了在復(fù)雜的細(xì)胞pH環(huán)境中檢測HSO3?的局限性。與以前報道的用于SO2衍生物的生物探針相比，基于邏輯與的熒光探針在性能和應(yīng)用上都有明顯的優(yōu)勢。 圖一. NY-Lyso的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其對HSO3-的傳感機(jī)理(圖片來源：Anal. Chem. 2019, 91, 11946?11951)探針由兩個功能部件組成:溶酶體靶向基團(tuán)嗎啉基和亞硫酸氫鹽的特異性結(jié)合位點(diǎn)。該設(shè)計(jì)策略允許探針同時具有兩個響應(yīng)位點(diǎn)，分別通過PET和ICT控制萘酰亞胺熒光團(tuán)的熒光。在亞硫酸氫鹽存在下，半花菁苷的共軛結(jié)構(gòu)被破壞，通過抑制ICT過程導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的部分增強(qiáng)。當(dāng)將SO2探針復(fù)合物暴露在酸性環(huán)境中，如溶酶體，嗎啉基團(tuán)將被質(zhì)子化，PET過程也被阻斷，然后導(dǎo)致發(fā)射強(qiáng)度顯著增加。由于溶酶體pH值在4.5到5.5之間，作者首先研究了在HSO3-存在和不存在的情況下，pH值對探針NY-Lyso光物理性質(zhì)的影響。如預(yù)期的那樣，結(jié)果表明pH對探針的作用非常重要。pH = 7.0時，在沒有HSO3-的情況下，NY-Lyso由于PET和ICT不發(fā)出熒光。當(dāng)加入HSO3-時，發(fā)射強(qiáng)度仍然保持在一個較低的值，說明PET過程仍然在起作用。當(dāng)pH值下降到6.0，對嗎啉基團(tuán)內(nèi)的N原子的質(zhì)子化作用阻礙了PET的作用,導(dǎo)致了在524 nm(Φf = 0.49)出現(xiàn)顯著的發(fā)射增強(qiáng)。隨著體系酸度的增加，HSO3-會優(yōu)先被H+捕獲，導(dǎo)致親核加成過程受阻，ICT過程被重新激活。為了驗(yàn)證這一機(jī)理，作者測試了一系列萘酰亞胺模型的光物理性質(zhì)。這些結(jié)果表明，NY-Lyso可作為pH活化熒光探針用于檢測HSO3-，在中性和堿性條件下保持沉默，在弱酸性條件下選擇性熒光激活。隨后，通過測量NY-Lyso在PBS溶液(10mm, 5% DMSO, pH = 5.5)中的吸收和熒光光譜變化，檢測其對HSO3-的光學(xué)響應(yīng)。探針NY-Lyso(10μM)顯示主要吸收在475nm。加入HSO3- (0?10當(dāng)量)后，475 nm處的峰值逐漸減小，顏色由淡黃色變?yōu)闊o色。這些變化可能是由于HSO3-阻斷了半花菁苷的共軛結(jié)構(gòu)，從而阻斷了ICT通路，因此探針的吸收光譜發(fā)生了顯著的藍(lán)移。且NY-Lyso(10 μM)幾乎沒有熒光發(fā)射。隨著HSO3-濃度的增加，在380 nm激發(fā)下，524 nm處出現(xiàn)明顯的熒光。當(dāng)十倍當(dāng)量HSO3-添加時,熒光強(qiáng)度達(dá)到最大。此外，通過分析探針在524 nm處的熒光強(qiáng)度，研究了探針的反應(yīng)動力學(xué)。在不同濃度的HSO3- (0- 60 μM)的條件下，隨著反應(yīng)時間逐漸增加，探針的熒光強(qiáng)度也逐漸增加,并在200 s達(dá)到平衡,并可以保持超過60分鐘的穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)表明，該探頭對SO2的響應(yīng)速度快，可用于SO2的實(shí)時成像。
圖二. PBS溶液(10mM,5% DMSO, pH = 5.5)中NY-Lyso(10 μM)在不同濃度的HSO3-(0-100μM)下的紫外光譜變化以及熒光光譜變化 (圖片來源：Anal. Chem. 2019, 91, 11946?11951)根據(jù)上述結(jié)果，作者通過記錄四種可能輸入條件下的熒光光譜，確定了探針在PBS緩沖液中的邏輯與特性。其中，H+和HSO3-為輸入，系統(tǒng)524 nm處的發(fā)射強(qiáng)度為輸出。對于輸入，存在和不存在H+或HSO3-分別定義為“1”和“0”。輸出熒光“ON”和“OFF”分別定義為“1”和“0”。當(dāng)有兩個輸入(1/1)時，熒光強(qiáng)度急劇增加，輸出信號為“1”。否則，在其他情況下(沒有輸入或僅輸入一個1)，熒光輸出為“0”。 圖三. 具有兩個輸入值的邏輯與門的邏輯方案和真值表 (圖片來源：Anal. Chem. 2019, 91, 11946?11951)在細(xì)胞外酸性條件下，NY-Lyso對亞硫酸氫鹽具有良好的光物理特性和響應(yīng)性能，因此作者繼續(xù)探索NY-Lyso對活細(xì)胞溶酶體中亞硫酸氫鹽成像的能力。作者首先對探針進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，探針對HeLa細(xì)胞的細(xì)胞毒性較低，說明NY-Lyso適用于活體細(xì)胞成像。與其他含有嗎啉基團(tuán)的溶酶體靶向探針相似，引入嗎啉基團(tuán)顯著增加了探針在溶酶體富集的可能性。為了研究NY-Lyso的溶酶體靶向性，進(jìn)行了共定位實(shí)驗(yàn)。HeLa細(xì)胞與探針NY-Lyso(10 μM), HSO3- (20 μM)和Lyso-Tracker(0.5 μM)在室溫下一起孵育30分鐘。如圖4所示，細(xì)胞在顯微鏡下顯示了來自NY-Lyso的綠色熒光通道，以及來自商業(yè)Lyso-Tracker的紅色熒光通道。合并后的圖像顯示兩個通道重疊良好， Pearson共定位系數(shù)為0.85，證實(shí)NY-Lyso可以在活細(xì)胞溶酶體中特異性定位。隨后，研究了探針對細(xì)胞內(nèi)HSO3-的檢測和成像能力。為了測試探針在細(xì)胞中的邏輯與特性，作者必須首先調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外的pH值。一種常用的方法是使用高鉀離子緩沖液將細(xì)胞的外部pH值維持為一個固定值，然后使用一種K+/H+離子載體的尼日利亞菌素將細(xì)胞內(nèi)部的pH值調(diào)節(jié)到相同的pH值。此外，分別用20 mM檸檬酸和20 mM HEPES制備pH為5.5和7.4的緩沖液。那么對于H+， pH值在5.5和7.4可以分別定義為1和0。HSO3-HSO3的存在和不存在也分別定義為1和0。如圖5所示，作者將細(xì)胞分為(1,0)、(0,1)、(1,1)三組，但在未處理的細(xì)胞和僅與HSO3-孵育的細(xì)胞中，細(xì)胞上沒有熒光。相比之下,用50μM HSO3-孵化后細(xì)胞在pH值5.5成功地觀察到524 nm的強(qiáng)烈綠色熒光。通過與細(xì)胞外實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較，作者成功地研制了一種基于邏輯與的熒光探針，用于活細(xì)胞中HSO3-的選擇性檢測。
圖四. 不同的pH值下NY-Lyso (10 μM)在HeLa細(xì)胞中對HSO3-成像的邏輯與行為 (圖片來源：Anal. Chem. 2019, 91, 11946?11951)總結(jié)：綜上所述，華東理工大學(xué)朱為宏、王成云、郭志前課題組開發(fā)了一種基于邏輯與的熒光探針NY-Lyso，通過PET和ICT機(jī)制的調(diào)控來檢測HSO3-。該探針對HSO3-具有較高的選擇性和敏感性(LOD = 20.7 nM)。探針的邏輯與行為允許其熒光在中性或堿性條件下保持沉默，但被低pH和HSO3-的共刺激激活。此外，它被證實(shí)具有生物相容性，可用于監(jiān)測活細(xì)胞中的溶酶體HSO3-。與傳統(tǒng)探針相比，該探針和基于邏輯與的探針避免了細(xì)胞環(huán)境中復(fù)雜的相互作用，具有更好的選擇性和更高的靈敏度。該方法具有較強(qiáng)的可實(shí)現(xiàn)性和實(shí)時性。 備注：邏輯代數(shù)有與、或、非三種基本邏輯運(yùn)算。它是按一定的邏輯關(guān)系進(jìn)行運(yùn)算的代數(shù)，是用來分析和設(shè)計(jì)數(shù)字電路的數(shù)學(xué)工具。有三種最基本的邏輯運(yùn)算：（1）邏輯與：當(dāng)A，B都為1時，其值為1，否則為零；（2）邏輯或：當(dāng)A，B都為0時，其值為0，否則為1；（3）邏輯非：當(dāng)A=0時，A的非為1，A=1時，A的非為0。
在線客服
快速發(fā)布
我的店鋪
我的化學(xué)加
我的消息
我要充值
回到頂部
