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產碳青霉烯酶腸桿菌科細菌（CPE）是一種革蘭氏陰性菌，它可通過位于細菌細胞間質的碳青霉烯酶有效水解碳青霉烯類抗生素的C-N鍵（如亞胺培南，美羅培南，厄他培南等），繼而導致這些藥物失效，使臨床抗感染治療陷入無藥可用的危機。同時因為大多數碳青霉烯酶基因位于質粒、整合子、轉座子等可轉移性基因元件上，可導致耐藥基因在不同菌種間快速傳播，誘發醫院內感染或爆發流行。鑒于其高感染率、高致死率和高傳播性，CPE已成為當今全球最嚴重的公共衛生威脅之一。酶的活性受其細胞內生理環境的精細調控，因此，評估天然細胞環境中碳青霉烯酶的酶促反應對于獲得其準確催化活性信息以及早期疾病檢測至關重要。

圖1.（a）實驗流程示意圖。（b）用亞胺培南或緩沖液滴定活KPC-Kp懸液的反應熱譜圖。 （c）用亞胺培南滴定陰性細菌懸液（ESBL-Kp和AmpC-Kp）和KPC蛋白的熱譜圖。（d）EDTA或舒巴坦對KPC-Kp水解亞胺培南熱譜曲線的影響。

由于任何酶促化學反應都伴有一定的熱量吸收或釋放，并且熱量的變化速率和酶催化速率成正比，因而反應量熱法可以為監測天然底物與酶的反應進程提供一種普適、有力的研究工具。又因為量熱法也適用于溶劑不透明或混濁的溶液，為復雜體系內研究酶活提供了可能。如圖1所示，作者通過比較產KPC 酶肺炎克雷伯菌懸液（KPC-Kp）與純化的KPC 酶溶液（A類碳青霉烯酶）水解亞胺培南過程中的熱譜曲線證實了細胞量熱法（in cell-calorimetry）的可行性。進一步，作者觀察到用KPC-Kp所得到的熱量變化可以被A類碳青霉烯酶抑制劑舒巴坦完全抑制，而B類碳青霉烯酶抑制劑EDTA對其沒有影響，證實熱變化曲線可以特異性地反映亞胺培南在活細菌中被水解的過程。

圖2. OXA-48型碳青霉烯酶催化亞胺培南（IMI）具有“雙相動力學”特征。補充CO₂對（a）量熱法中OXA-48-Kp懸液和（b）紫外光譜法中OXA-48-Kp裂解上清液水解亞胺培南的催化活性的影響。

隨后作者揭示了OXA-48型碳青霉烯酶的熱譜曲線具有特異的“雙相動力學”特征（圖2）。該特征隨NaHCO₃濃度的提高而消失，證實OXA-48酶在催化過程中其活性中心的賴氨酸會發生去羧基化，進一步導致酶在催化過程中失活，該特征可以作為特征“指紋”圖譜用于攜帶OXA-48細菌的特異性檢測。同時作者對比了量熱法和紫外分光光度法檢測OXA-48型碳青霉烯酶水解活性的譜圖，發現量熱法可以更靈敏地揭示催化過程中反應速率的變化，因此在研究這種特殊的反應機理方面具有顯著優勢。

圖3.比較了分別使用（a）量熱法和（b）Carba-NP法檢測產KPC碳青霉烯酶活細菌的靈敏度。

接著，作者對量熱法檢測產碳青霉烯酶細菌的靈敏度做了測試，并將其與臨床實驗室廣泛采用的Carba NP方法進行了比較（圖3）。結果表明細胞量熱法可以準確檢測所有臨床常見的碳青霉烯酶，檢測下限為3-19 nM碳青霉烯酶（10⁶-10⁸ 細菌）。該結果比Carba NP方法檢測靈敏度至少高2個數量級。

圖4. 細胞量熱法檢測142株臨床細菌的結果及其與其它方法的對比。碳青霉烯酶陽性樣品標記為“+”，碳青霉烯酶陰性樣品標記為“ - ”。紅色虛線表示細胞量熱法的檢測閾值。

作者最后對細胞量熱法在CPE快速檢測領域的應用進行了驗證（圖4）。實驗采用了來自西安交通大學第一附屬醫院分離的142株臨床細菌作為樣品，分別采用細胞量熱法、Carba NP方法、mCIM法、MHT法和MIC法進行平行實驗。檢測結果表明細胞量熱法具有最佳檢測靈敏度（97％）和特異性（100％），在檢測時間方面也具有明顯優勢（10分鐘內），有望應用于臨床耐藥細菌的快速檢測。

總結：本文報道了一種基于碳青霉烯酶催化底物過程中的“熱信號”變化來特異性、實時、原位跟蹤細胞內酶活的實驗方法，并證明了該技術在新型催化機理和快速鑒定臨床CPE方面的應用。由于細胞量熱法概念簡單，易于應用于復雜生物體系（例如，腫瘤細胞、免疫細胞和囊泡等），因而具有廣泛應用前景。

通訊作者介紹

和媛，女，化學博士，西北大學化學與材料科學學院副教授，碩士研究生導師，第八批“陜西省百人”。 2011年獲得英國約克大學 (the University of York) 博士學位，2011-2013年分別在加拿大Simon Fraser University（David Vocadlo 教授實驗室）和美國斯克利普斯研究所 (The Scripps Research Institute; Jim Paulson 教授實驗室) 進行博士后研究，2013年加入西北大學。和媛副教授課題組主要從事疾病相關靶酶反應機理及活性調控研究，主要研究手段包括：X-射線晶體衍射、酶學、等溫滴定微量熱（ITC）等。研究成果發表在包括Angewandte Chemie, JACS, Nature Structural & Molecular Biology, Nature Chemical Biology 等在內的著名國際期刊。現主持國家自然科學基金和陜西省擇優資助項目。

徐紀茹，女，醫學博士，西安交通大學醫學部基礎醫學院病原生物學教授、博士研究生導師，陜西省“三秦人才”。1982年獲西安醫學院醫學學士學位，1990年獲西安醫科大學醫學碩士學位，2001年獲得英國貝爾法斯特Ulster大學博士學位，2004年聘為西安交通大學醫學院病原生物學教授。主要研究方向：1. 正常菌群與宿主的依存關系；2. 感染性疾病的分子診斷；3. 細菌耐藥基因研究。共發表論文100余篇，培養博士和碩士研究生30余名。主要社會任職：1. 中國微生物學會真菌專業委員會委員；2.中國微生物學會微免專業委員會委員；3. 陜西省微生物學會副理事長；4. 陜西省醫學會微生物學與免疫學分會副主任委員。