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NIR-I（700-1000 nm）和NIR-II（1000-1700 nm）染料因其對皮膚和組織的強穿透力而在生物成像領域備受青睞。目前商用近紅外染料ICG和IRdye800CW存在著生物偶聯效果較差的缺陷。此外，ZW800-1作為一種近紅外離子型染料，因其親水性和腎臟代謝清除速率快等優勢而被廣泛應用。然而，由于ZW800-1分子骨架中親核位點的存在導致其在生理環境下易受到生物分子的“進攻”，從而導致熒光信號丟失，不利于長時間動態示蹤。下載化學加APP到你手機，更加方便，更多收獲。

Scheme 1. （a）分子的設計概念和（b）化學結構

（圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.）

基于此，作者發展了設計合成NIR-I花菁染料的新方法（Scheme 1），即分子的平面骨架由2個或者4個側鏈基團進行“保護”，該“雙帶隔離”型的共軛NIR-I和NIR-II染料表現出性能的提升。作者利用該策略合成了dsZW800-1分子，由此解決了ZW800-1的熒光信號減弱問題。此外，所合成的分子dsZW1015的吸收和發射峰位置更是達到了NIR-II發射區域，再次證明了該設計策略的通用性。最后，dsZW1015與抗體進行偶聯后的探針還實現了對腫瘤小鼠的體內NIR-II成像。

Scheme 2. 中間體4和化合物dsZW800-1的合成路線

（圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.）

dsZW800-1的合成過程如Scheme 2所示。關鍵合成中間體是未束縛染料3，在溫和的條件下通過將前體1中的4'-氯原子用含有兩個末端端點為偶氮基團的酚2進行置換而組裝而成。隨后的皂化反應將3轉化為未束縛染料4，然后通過銅催化的偶氮基-炔烴環加成反應，將兩個側鏈帶連接起來，產率達62%。

Figure 1. （a）dsZW800-1晶體結構的側視和端視圖；（b）dsZW800-1晶體結構中的層間距

（圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.）

單晶結構側面證實了分子內屏蔽效應的存在（Figure 1）。一般情況下，七甲川花菁染料中的滑移面分子間距在3.5-5 ?，而dsZW800-1中熒光分子的間距為9 ?。因此，在聚集態下，“雙帶”基團可以增大分子間距，減小染料的偶極-偶極相互作用。相比于ZW800-1而言，dsZW800-1的最大吸收和發射峰位置沒有明顯變化，而在水溶液中的熒光量子產率則有所提升。這也意味著“雙帶隔離”策略能夠有效抑制染料分子與周圍水環境作用所產生的非輻射躍遷過程。

Figure 2. 光照射下化合物的光穩定性數據

（圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.）

此外，作者利用氙燈照射ZW800-1、4和dsZW800-1的PBS緩沖溶液。通過實驗數據可知，光學穩定性的強弱順序依次為4 > dsZW800-1和ZW800-1（Figure 2）。4和dsZW800-1穩定性的提高得益于位阻屏蔽基團能夠有效降低氧氣的光敏化速率，抑制生物分子與單線態氧的相互作用。 

Figure 3. （a）ZW800-1和GSG的反應產物；（b）染料穩定性比較

（圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.）

接下來，作者將三種染料與谷胱甘肽（GSH）在PBS緩沖液中進行培養。親核基團發生反應后很容易造成花菁染料的吸收峰位置發生紅移（Figure 3a）。通過采集不同培養時間下染料的發光強度可知，具有“雙帶隔離”保護的dsZW800-1能夠十分有效地抑制分子中的親核位點發生反應，從而降低在生理環境下探針熒光信號丟失的風險（Figure 3b）。

Figure 4. （a）室溫下Pan-dsZW800-1在PBS緩沖液中的吸收光譜；（b）不同時間段Pan-dsZW800-1染料在荷瘤小鼠體內的成像信噪比；（c）小鼠的體內熒光圖像；（d）小鼠體內不同器官的明場、熒光照片和（e）熒光信號分布

（圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.）

作者還對dsZW800-1的體內成像性能進行了考察，即將染料與Panitumumab （Pan）抗體相連。偶聯抗體后的Pan-dsZW800-1的激發波長為772 nm，熒光光譜與dsZW800-1一致（Figure 4a），表明染料未發生聚集。此外，借助商用近紅外體內成像裝置可以看出探針在注射72 h后的成像信噪比達到8，肝臟處的熒光信號可忽略不計（Figure 4b-c）。同時，檢測提取小鼠的各個臟器的熒光信號也說明Pan-dsZW800-1具有很高的腫瘤特異性（Figure 4d-e）。

Scheme 3.化合物dsZW1015的合成路線

（圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.）

為了進一步提高染料的發射波長，作者設計合成了NIR-II發射的分子dsZW1015（Scheme 3）。通過將dsZW1015中的琥珀酰亞胺酯基團與Pan相連，得到的PandsZW1015在1000 nm處表現為強吸收峰，并且沒有明顯的染料聚集現象（Figure 5a）。此外，在注射探針72 h后，腫瘤部位仍能保持很高的熒光信號值（Figure 5b）。實驗數據再次證明了將dsZW1015與特異性抗體偶聯后，探針可有效地被用于NIR-II成像當中（Figure 5c）。

Figure 5. （a）室溫下Pan-dsZW1015在PBS緩沖液中的吸收光譜；（b）不同時間段Pan-dsZW1015染料在荷瘤小鼠體內的成像信噪比；（c）注射/未注射Pan-dsZW1015染料的小鼠明場和熒光圖像

（圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.）

美國圣母大學Bradley D. Smith教授團隊報道了一系列高性能的七甲川花菁染料。與傳統NIR-I染料ZW800-1相比，dsZW800-1展現出明亮發射以及更好的化學穩定性。此外，實驗數據還表明dsZW800-1更適合作為用于動態追蹤的靶向探針。通過空間屏蔽和平衡電荷的結構組合，對dsZW1015中熒光染料的增強疏水性進行抵消，從而產生標記有染料的抗體，有效地用于活體小鼠的近紅外II區腫瘤熒光成像。探針的理性分子設計法則也為后續“比率型”和“on-off”近紅外探針的發展提供了參考。