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圖1. 多細(xì)胞冷凍電子斷層掃描樣品制備流程示意圖

該方法通過改進冷凍樣品制備方法，使得樣品能夠完整且迅速地從冷凍填充劑中暴露出來（圖1e），避免了傳統(tǒng)冷凍保護劑所引入的樣品定位難題（圖1d），從而大大縮短了樣品準(zhǔn)備時間；通過優(yōu)化lift-out樣品減薄流程，在極大縮短樣品減薄時間的同時大幅度提升成功率；通過設(shè)計新型電鏡載網(wǎng)為薄片提供更好的機械支撐，最終可以獲得穩(wěn)定的較大薄區(qū)（圖1f, 1g）。此研究為組織等多細(xì)胞樣品的冷凍電鏡原位結(jié)構(gòu)研究提供了一種流程更簡單、耗時更短、成功率更高的新方案。

采用此方法，研究者對小鼠胰島進行冷凍電鏡原位結(jié)構(gòu)觀察，首次實現(xiàn)了β細(xì)胞胰島素晶體的原位分析（圖2）。研究者觀察到三種不同類型的囊泡，分別為棒狀晶體囊泡（圖2h），未成熟胰島素晶體囊泡（圖2i）以及成熟的胰島素晶體囊泡（圖2j），并對囊泡的數(shù)量與位置分布進行了統(tǒng)計（圖2a，2k）。分析結(jié)果表明，成熟的胰島素晶體囊泡占97%，且不同類型的胰島素囊泡分布無明顯特征。而此前使用單細(xì)胞體系研究發(fā)現(xiàn)，不同成熟狀態(tài)的胰島素囊泡呈現(xiàn)有組織的空間分布，說明了組織等多細(xì)胞原位結(jié)構(gòu)研究的必要性。

圖2. 胰島β細(xì)胞的原位結(jié)構(gòu)

通過對此流程所收集的數(shù)據(jù)進行了分析（圖3），研究者原位確定了胰島素的晶胞參數(shù)（圖3c—f）。其與體外觀察到的六方晶體的結(jié)構(gòu)差異則表明細(xì)胞內(nèi)生理條件對晶體堆積的潛在影響。

圖3. 胰島素晶體原位晶胞參數(shù)測定

郭強為本文的通訊作者。郭強課題組博士生吳伊春、北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院秦昌東博士、郭強課題組技術(shù)員杜文靜為本文的共同第一作者，北京大學(xué)陳良怡教授和郭振璽博士為該工作作出了重要貢獻。本工作中的樣品制備與數(shù)據(jù)收集在北京大學(xué)冷凍電鏡平臺完成，數(shù)據(jù)處理獲得了北京大學(xué)未名超算平臺的硬件和技術(shù)支持。該研究得到了科技部重點研發(fā)計劃、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心、生命科學(xué)學(xué)院、SLS-啟東創(chuàng)新基金、蛋白質(zhì)與植物基因研究國家重點實驗室以及昌平實驗室的經(jīng)費支持。