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圖1. 多細胞冷凍電子斷層掃描樣品制備流程示意圖

該方法通過改進冷凍樣品制備方法，使得樣品能夠完整且迅速地從冷凍填充劑中暴露出來（圖1e），避免了傳統冷凍保護劑所引入的樣品定位難題（圖1d），從而大大縮短了樣品準備時間；通過優化lift-out樣品減薄流程，在極大縮短樣品減薄時間的同時大幅度提升成功率；通過設計新型電鏡載網為薄片提供更好的機械支撐，最終可以獲得穩定的較大薄區（圖1f, 1g）。此研究為組織等多細胞樣品的冷凍電鏡原位結構研究提供了一種流程更簡單、耗時更短、成功率更高的新方案。

采用此方法，研究者對小鼠胰島進行冷凍電鏡原位結構觀察，首次實現了β細胞胰島素晶體的原位分析（圖2）。研究者觀察到三種不同類型的囊泡，分別為棒狀晶體囊泡（圖2h），未成熟胰島素晶體囊泡（圖2i）以及成熟的胰島素晶體囊泡（圖2j），并對囊泡的數量與位置分布進行了統計（圖2a，2k）。分析結果表明，成熟的胰島素晶體囊泡占97%，且不同類型的胰島素囊泡分布無明顯特征。而此前使用單細胞體系研究發現，不同成熟狀態的胰島素囊泡呈現有組織的空間分布，說明了組織等多細胞原位結構研究的必要性。

圖2. 胰島β細胞的原位結構

通過對此流程所收集的數據進行了分析（圖3），研究者原位確定了胰島素的晶胞參數（圖3c—f）。其與體外觀察到的六方晶體的結構差異則表明細胞內生理條件對晶體堆積的潛在影響。

圖3. 胰島素晶體原位晶胞參數測定

郭強為本文的通訊作者。郭強課題組博士生吳伊春、北京大學生命科學學院秦昌東博士、郭強課題組技術員杜文靜為本文的共同第一作者，北京大學陳良怡教授和郭振璽博士為該工作作出了重要貢獻。本工作中的樣品制備與數據收集在北京大學冷凍電鏡平臺完成，數據處理獲得了北京大學未名超算平臺的硬件和技術支持。該研究得到了科技部重點研發計劃、北大-清華生命科學聯合中心、生命科學學院、SLS-啟東創新基金、蛋白質與植物基因研究國家重點實驗室以及昌平實驗室的經費支持。