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細胞-細胞相互作用是生命過程中最基本的信息傳遞方式之一，在免疫應答、組織發育和神經傳導過程中發揮重要作用，了解細胞間相互作用對于理解免疫過程的生物學基礎和疾病發病機制及發展細胞免疫療法都具有重要意義。

目前，研究人員已經開發了許多用于研究細胞-細胞相互作用的工具。包括顯微鏡成像技術、基于鄰近效應的化學標記策略、用于檢測細胞間相互作用的機械力拉伸策略、以功能為導向的對細胞間相互作用進行探索的手段以及單細胞基因表達為基礎的預測分析方法等。開發這些技術的目的是為了解決一些關鍵的生物學問題，如：細胞-細胞相互作用發生在哪些位置？相互作用的空間和組織結構是怎樣的？哪些細胞能夠發生相互作用？有哪些生物大分子介導細胞間相互作用？如何通過操控這些生物大分子來調控細胞間的相互作用等。

近年來，通過鄰近標記效應為基礎的化學標記策略捕獲細胞-細胞相互作用是化學生物學的研究熱點，該策略已經被證明是研究細胞間相互作用的強有力工具，其主要過程是將酶或小分子催化劑裝載到一種細胞上，這種細胞通常被稱之為誘餌細胞，在酶或小分子催化劑催化下激活溶液中連有生物素的底物，將其標記到與誘餌細胞相互作用的細胞上，進而對細胞-細胞相互作用進行捕獲（圖1）。由于該策略可以通過鏈霉親和素對生物素信號進行親和富集，再通過質譜、凝膠成像、顯微鏡、流式細胞儀或基因測序進行檢測和下游分析，能夠極大程度實現我們研究細胞間相互作用想要解決關鍵生物學問題的目的，所以開發更有效的研究細胞間相互作用的鄰近標記工具十分必要。

圖1 鄰近標記工具捕獲細胞間相互作用流程及應用

近年來，南京大學化學化工學院李劼團隊和合作者一起利用酶和小分子催化劑設計構建了多種用于研究細胞間相互作用的鄰近標記工具（Cell, 2020, 183, 1117；J. Am. Chem. Soc., 2022, 144, 5517）。為了進一步滿足免疫學和醫學中的不同應用場景，他們基于之前用于研究DC-T細胞間相互作用的FucoID技術，利用巖藻糖轉移酶（FT）的定點化學偶聯發展了細胞-酶偶聯體探針（Cell-sFT）和抗體-酶偶聯體探針（Ab-sFT）。當有其它細胞與誘餌細胞相互作用時，FT可以將鳥苷二磷酸巖藻糖生物素（GDP-Fucose-Biotin）的底物標記到與誘餌細胞相互作用的細胞上的N-乙酰-D-乳糖胺（LacNAc）上，進而對細胞間相互作用實現捕獲。另外，他們還利用過渡金屬釕配合物Ru(bpy)₃²⁺開發了光控的Ru-¹O₂-hydrazide系統用于捕獲細胞-細胞相互作用，通過生物正交反應分別將Ru(bpy)₃²⁺與1，2-雙（二苯膦）乙烷（DPPE）、抗體（Herceptin）和鳥苷二磷酸巖藻糖（GDP-Fucose）偶聯在一起，合成了三種Ru(bpy)₃²⁺衍生物：Ru-L、Ru-G和Ru-H，成功實現將Ru(bpy)₃²⁺裝載到誘餌細胞表面的脂質、蛋白質和糖分子上，在450 nm光照和底物生物素酰肼（Biotin-hydrazide）存在下通過單線態機理對細胞間相互作用實現捕獲（圖2）。

圖2 鄰近標記工具箱中所含的探針、裝載和作用機理

Cell-sFT、Ab-sFT、Ru-L、Ru-G和Ru-H這些探針共同組成了研究細胞-細胞相互作用的鄰近標記工具箱，利用這些探針他們將酶或小分子催化劑分別裝載到了鼠的樹突細胞、癌細胞和OT-I T細胞、人的CAR-T細胞和癌細胞上，對由肽主要組織相容復合物-T細胞受體（pMHC-TCR）所介導的樹突細胞-T細胞、癌細胞-T細胞和T細胞-樹突細胞間的相互作用、由嵌合抗原受體-抗原（CAR-antigen）所介導的T細胞-癌細胞間的相互作用和程序性死亡受體-配體（PD-1-PD-L1）所介導的T細胞-癌細胞間的相互作用實現成功捕獲，展現了鄰近標記工具箱捕獲細胞間相互作用的通用性；另外他們還闡述了工具箱捕獲細胞間相互作用具有可定量性、高選擇性和高分辨（Ru-¹O₂-hydrazide系統）等特點（圖3）。值得指出的是，該系統可以實現對CD4 T細胞和不同抗原呈遞細胞的特異性和異質性的解析，解決了免疫學研究中二類分子MHC多聚體和TCR多聚體難以構建的問題。

圖3 鄰近標記工具箱研究細胞-細胞相互作用的特點

在未來的免疫學研究中，細胞間鄰近標記工具可以廣泛應用于發現未知的細胞間相互作用。例如，李劼團隊利用其開發的Cell-sFT探針，成功揭示了樹突狀細胞（DC）與B細胞間存在的強相互作用，并在鄰近標記下游結合轉錄組測序分析闡述了DC-B細胞相互作用的機制，為將來研究人員發現更有意義的未知細胞間相互作用及機制提供了研究范式（圖4）。未來的研究可以探索將鄰近標記工具箱與單細胞測序分析平臺相結合的可能性。這種結合可以更加方便和高效地了解介導細胞相互作用的分子信息，為人們深入理解維持正常生理過程和引起疾病發病過程中的重要細胞相互作用及其機制提供了新思路。

圖4 利用細胞間鄰近標記工具發現未知的細胞間相互作用。

上述研究成果以“Use of Intercellular Proximity Labeling to Quantify and Decipher Cell-cell Interactions Directed by Diversified Molecular Pairs”和“Ru(bpy)₃²⁺-Enabled Cell-Surface Photocatalytic Proximity Labeling toward More Efficient Capture of Physically Interacting Cells”為題分別發表在Science Advances和Angewandte Chemie International Editions雜志上，文章鏈接：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.add2337 和https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/anie.202303014。李劼教授為上述文章的通訊作者，化學化工學院博士生邱爽、鄧濤和碩士生李皖楠為上述文章的第一作者。該工作得到國家重點研發計劃（2019YFA09006600）、國家自然科學基金（21977048，92053111）、江蘇省自然科學基金（BK20202004）、北京分子科學國家實驗室（BNLMS202008）及南京大學卓越計劃的資助。

研究人員可以根據不同的目的和需求，有針對性地從鄰近標記工具箱中選擇合適的工具來探究不同的細胞間相互作用。李劼團隊非常樂意分享細胞間鄰近標記工具，并根據具體生物應用場景協助進一步“定制”開發工具。